张文艳，陈 茜，李俊杰，赵仲霞

（昭通学院，云南昭通 657000）

花椒属芸香科，在全球范围内大概有200多种，主要品种为青椒和花椒[1]。花椒属植物主要活性成分为挥发油[2]、生物碱类化合物、香豆素[3]等。生物碱[4]是一类含氮有机化合物，具有抗氧化[5]、抗肥胖、抗糖尿病[6]、抗菌[7]等活性。花椒生物碱是花椒属植物中普遍含有的一类物质[8]，花椒中被发现的生物碱主要有香草柠[9]、和帕洛平[10]、青椒碱[11]。生物碱的主要检测方法有电位滴定[12]、紫外吸收、酸性染料比色[13]等，提取方法主要有水提取、氨-氯仿[14]、有机溶剂、超声波等[15]。

青花椒在云南省的大部分地区均有分布和栽培[16]，昭通地区青花椒种植面积超过6.7万 hm2，产量占全省的60%～70%[17]，主要分布在金沙江、牛栏江、关河、洛泽河流域[18]，海拔400～1 800 m的永善县务基镇、黄华镇、大兴镇、马口镇，鲁甸县龙头山镇、梭山乡，彝良县角奎镇、洛泽河镇，巧家县红山乡、大寨乡等乡镇[19-20]。本文以昭通大关县青花椒为原料，采用醇提法考察生物碱提取量，以DPPH、ABTS+为检测指标，探究花椒生物碱的抗氧化作用，以期为昭通金江花椒作为天然抗氧化剂在食品中的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

青花椒（昭通大关县）；白屈菜红碱标准品（江苏永健医药科技公司）；溴麝香草酚蓝（成都科隆化学品有限公司）；无水乙醇、无水甲醇（天津风船化学试剂科技有限公司）；DPPH自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测试盒（南京建成生物工程研究所）；96孔板（NEST）；移液枪（大龙）；多功能酶标仪（Moleculart Devuces）；紫外分光光度计（日本岛津公司）；超声双频清洗机（宁海新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

参照姜华等[21]的方法，称取60目花椒粉加入乙醇溶液，室温避光浸泡24 h，设置温度、时间进行超声后回流提取2 h，收集滤液浓缩至浸膏状备用。将花椒浸膏用无水乙醇配制一定浓度后，取200 μL于离心管中，加入相应浓度的乙醇溶液800 μL进行溶解，加入400 μL溴麝香草酚蓝溶液，摇匀后加入2 mL三氯甲烷，静置30 min，取三氯甲烷层进行测定。以相应浓度乙醇溶液做空白，在波长417 nm下用酶标仪检测生物碱吸光值，根据标准曲线计算花椒中生物碱含量。

1.2.2 对照品的配制

称取5.00 mg白屈菜红碱标准品，加无水乙醇定容至25 mL混匀，即为0.2 mg·mL-1的对照品溶液。

1.2.3 测定波长的确定

取两支比色管，加入200 μL对照品溶液、200 μL花椒生物碱浸膏液，加去离子水至1 mL后加入pH值为7.6的400 μL溴麝香草酚蓝缓冲溶液，加入2 mL三氯甲烷后按照1.2.1方法进行测定。以酸性染料缓冲溶液的三氯甲烷为空白，进行全波长扫描。扫描结果如图1所示，白屈菜红碱与花椒生物碱在289 nm和417 nm处存在较高的吸收峰，结合后续标准曲线测定发现，417 nm下回归方程相关系数R2较好，最终选择417 nm为测定波长。

图1 白屈菜红碱与花椒生物碱全波长扫描图谱

1.2.4 白屈菜红碱标准曲线的绘制

分别取5只比色管标号，依次加入0 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL 白屈菜红碱标准品后，加水至 1 000 μL，再分别加入 400 μL、pH 7.6的溴麝香草酚蓝缓冲溶液，加入2 mL三氯甲烷振荡2 min，按照1.2.1方法进行测定。空白为三氯甲烷酸性染料缓冲溶液，在417 nm处测定后作图，得白屈菜红碱标准曲线y=1.74x-0.002 5，R2=0.966 2，表明其具有良好的线性关系，可作为标准曲线使用。

1.2.5 花椒生物碱提取条件的确定

以花椒生物碱含量为检测指标，探究乙醇浓度（%）、超声时间（min）、超声温度（℃）、料液比（g∶mL）对花椒生物碱提取率的影响，确定最适的花椒生物碱提取条件。

1.2.6 正交试验设计

根据单因素试验结果，正交试验采用L9(34)的方法（表1）进行试验，确定最佳生物碱提取工艺。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3 花椒生物碱活性检测

1.3.1 DPPH自由基清除率的测定

参照试剂盒说明书，将花椒生物碱稀释90倍后25 ℃避光反应30 min，在517 nm下检测。清除率公式表示为

式中：A0为样品测定吸光值；A1为样品对照吸光值；A2为空白吸光值。

1.3.2 总抗氧化能力的测定

参照试剂盒说明书，将花椒提取液稀释150倍后25 ℃反应6 min，在405 nm下检测。

2 结果与分析

2.1 花椒生物碱提取条件的确定

2.1.1 乙醇浓度对花椒生物碱得率的影响

分别测定乙醇浓度65%、70%、75%、80%、85%对花椒生物碱得率的影响。由图2可得，乙醇浓度在75%时，花椒生物碱得率最高。

图2 乙醇浓度对花椒生物碱得率的影响

2.1.2 超声时间对花椒生物碱得率的影响

分别测定超声时间40 min、50 min、60 min、70 min、80 min对花椒生物碱得率的影响。由图3可得，超声时间为60 min时，花椒生物碱得率最高。

图3 超声时间对对花椒生物碱得率的影响

2.1.3 超声温度对花椒生物碱得率的影响

分别测定超声温度 10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃对花椒生物碱得率的影响。由图4可得，超声温度为40 ℃时，花椒生物碱得率最高。

图4 超声温度对花椒生物碱得率的影响

2.1.4 料液比对花椒生物碱得率的影响

分别测定料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35对花椒生物碱得率的影响。由图5可得，料液比为1∶25时，花椒生物碱得率最高。

2.2 正交试验设计

正交试验设计与结果见表2。由表2中R值可知，乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间4个因素对花椒生物碱得率的影响程度依次为料液比＞超声温度=超声时间＞乙醇浓度。通过正交试验分析，生物碱得率最高是 1.410 μg·mL-1，对应组合为A2B2C3D3，即乙醇浓度为75%、料液比（g∶mL）1∶25、温度50 ℃、时间70 min。通过极差分析，生物碱最佳提取工艺为A2B2C1D1，即乙醇浓度为75%、料液比（g∶mL）1∶25、温度30 ℃、时间50 min。因此进行了验证试验，结果表明，花椒生物碱提取工艺为A2B2C1D1时，得率 1.553 μg·mL-1，高于 1.410 μg·mL-1，即在乙醇浓度为75%、料液比（g∶mL）1∶25、温度30 ℃、时间50 min的提取条件下，花椒生物碱得率最高。

表2 正交试验及结果分析

2.3 花椒生物碱提取物抗氧化性检测

分别按照DPPH和ABTS+自由基清除能力试剂盒方法制得以下标准曲线y=0.066 5x+0.040 4，R2=0.983 4和y=-0.638 3x+1.661 6，R2=0.990 1，均具有良好的线性关系，可作为标准曲线使用。花椒生物碱提取液对DPPH、ABTS+自由基的清除能力分别如下：稀释90倍的花椒生物碱提取液的DPPH自由基清除能力为 642.937 5 μg Torlox/mL，比对照高15%；稀释150倍的花椒生物碱提取液对ABTS+自由基的清除能力相当于18.47 mmol·L-1的Trolox溶液，比对照高8%，表明花椒生物碱提取液具有良好的抗氧化活性。

3 结论

本文对昭通金江花椒生物碱提取工艺及抗氧化作用进行研究，测定花椒生物碱在不同提取条件下生物碱得率的变化及抗氧化能力。结果表明，采用60目花椒，在乙醇浓度75%、料液比1∶25、超声时间50 min、超声温度30 ℃的提取条件下，花椒生物碱得率最高，对DPPH自由基的清除能力达到642.9375 μg Torlox/mL，对 ABTS+自由基的清除能力相当于18.47 mM的Trolox溶液，表明其具有良好的抗氧化作用。