侯俊宁，王璇姝，余 权，陈奕峤，姚小艳，杨粤军

（湖南师范大学医学院，湖南长沙 410006）

沙门氏菌作为一种致病菌，其引起的症状主要有恶心、呕吐、腹泻等，平均致死率为4.1%[1]。在大多数国家由沙门氏菌引起的食源性疾病居细菌性食源性疾病的首位[2]。若滥用抗生素来治疗沙门氏菌病，则会导致沙门氏菌对多种抗生素的耐药性日益加剧。因此，需要迫切研制出针对沙门氏菌有高疗效且不会引起耐药性的药物。纳米技术作为如今研究的热点，为耐药细菌感染治疗提供了有效的选择，其中氧化石墨烯纳米银复合材料（GO-Ag）最具代表性。

纳米银具有小尺寸效应、较大的表面积，抗菌性能优良，但其易发生氧化而影响其抗菌性能[3]。氧化石墨烯是石墨烯的衍生物之一，能够负载多种抗菌材料，如纳米银、纳米铜等，这些复合物具备更强的抗菌性能[4]。已有研究发现，氧化石墨烯纳米银复合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等多种细菌均有良好的抗菌作用。但有关GO-Ag对沙门氏菌的抗菌效果的研究很少。

因此，本研究旨在利用GO-Ag对市场猪肉中分离得到的沙门氏菌进行体外抗菌实验，探究其对沙门氏菌的抗菌效果，为临床治疗沙门氏菌感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原位还原法合成GO-Ag：将0.88 mg硝酸银在不断搅拌下加入0.44 mL 2 mg·ml-1GO中混匀，并加入H2O至100 mL，在100 ℃油浴中煮沸，再加入40 mg柠檬酸三钠，充分混匀，1 h后离心去上清液并水洗多次，将沉淀物置于无菌去离子水中超声分散后得到所需的GO-Ag悬浊液。原液浓度为600 ug·mL-1。

新鲜猪肉，长沙市某生鲜市场猪肉摊贩；BPW、HE琼脂、LB琼脂、MH肉汤和RV肉汤，青岛海博生物技术有限公司；沙门氏菌属诊断血清、肠杆菌科试剂鉴定盒，湖南佑峰科技有限公司；生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；电热压力灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；电热恒温干燥箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采集样本

采用灭菌棉签擦拭猪肉进行取样，置于装有25 mL BPW的灭菌锥形瓶中，取样10份。2 h内冷冻运送至实验室进行前增菌培养。

1.2.2 前增菌培养

将样液置于装有225 mL BPW三角瓶中，充分摇匀后置于恒温箱中37 ℃培养8 h。

1.2.3 选择性增菌培养

称取RV肉汤2.71 g，制成溶液，高温高压灭菌20 min，备用。取1 mL增菌液置于10 mL RV肉汤试管中，于42 ℃培养18～24 h。

1.2.4 分离培养

称取HE（琼脂）30.24 g煮沸溶解，冷却后进行倒平板。用接种环挑取增菌培养液接种于HE平板上，于37 ℃恒温箱培养24 h。

1.2.5 纯化培养

用接种针挑取少量HE平板中疑似菌落接种于HE平板和克氏双糖铁培养基中。于37 ℃恒温培养24 h。

1.2.6 生化鉴定实验

用接种环挑取可疑菌落置于生化培养液中研磨，调整细菌浊度至0.5麦氏单位，吸取100 μL加入各生化试验孔。置于相对湿度≥70%，35 ℃培养箱中培养。培养16～20 h后，判读并记录结果。

1.2.7 常量肉汤稀释法测MIC

配制好浓度为0.4 mg·mL-1的GO-Ag。取11只普通试管并编号，除第一管加入1.36 mL MH肉汤外，其余各管加入1 mL MH肉汤，121 ℃，高压灭菌15 min。吸取0.4 mg·mL-1GO-Ag 0.64 mL于1号试管中并充分混匀，再吸取1 mL至2号试管中，充分混匀。依次类推至第9号试管，使9只试管浓度分别为 128.0 μg·mL-1、64.0 μg·mL-1、32.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1。 再 用 接 种 环 挑 取 菌 落于装有生理盐水的试管中校正至0.5麦氏比浊标准浓度，吸取0.1 mL至1～10号试管中，其中第10号试管作为菌液对照组，另取11号管中加入1 mL MH肉汤作为阴性对照，置于35 ℃恒温箱中培养16～20 h后观测结果。根据NCCLS标准读取MIC，即在读取结果前先检查10号管中细菌的生长情况是否良好，以及11号管是否有杂菌污染，同时以肉眼观察各药物浓度组试管，药物最低浓度管无细菌生长者即为受试菌的MIC。

1.2.8 倾注平板计数法

取15个平皿分成3组，分别标记浓度为64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1。配制 GO-Ag浓度分别为 64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1，菌液浓度为1×103CFU·mL-1的混合液，充分混匀后倒置于5个平板中，于35 ℃恒温箱中培养18～24 h 后计数菌落。取5 个平板，倒入 20 mL 64 μg·mL-1环丙沙星和1×103CFU·mL-1菌液的LB琼脂混合液作为阳性对照。取5个平板，倒入20 mL菌液浓度1×10 CFU·mL-1的LB琼脂混合液作为阴性对照（计数结果*100为最终计数结果）。取5个平板，倒入20 mL配制好的LB琼脂作为空白对照。倒置于恒温箱中37 ℃培养18～24 h后计数。

2 结果与分析

2.1 GO-Ag制备及表征

合成的GO-Ag外观为灰色液态，紫外光谱显示其在400 nm附近出现了明显的吸收峰，此为纳米银的特征吸收峰，表明有大量的银颗粒生成（见图1）。

图1 GO-Ag材料紫外光谱表征图

2.2 分离株的培养及形态特性

HE平板上长出中心为黑色，周围为蓝绿色的菌落；克氏双糖铁试管中试管上部为红色，下部为黑色，符合沙门氏菌培养及形态特性。

2.3 生化鉴定结果

运用自动分析系统分析实验结果，分离菌株有98.61%的鉴定概率为沙门氏菌（见表1）。

表1 生化鉴定结果

2.4 MIC的测定结果

肉眼观察到2号试管即GO-Ag浓度为64 μg·mL-1的试管中澄清，与空白对照管相一致，即肉眼下判定为无细菌生长，实验结果重复3次，因此可判定该GO-Ag对该株猪霍乱沙门氏菌的MIC 为 64 μg·mL-1（见图 2）。

图2 常量肉汤稀释法MIC结果

2.5 平板菌落计数结果

图3中a、b、c及e分别代表当GO-Ag浓度为64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1及环丙沙星浓度为 64 μg·mL-1的菌落图。图 3 中（d）为阴性对照。由图3观察到当复合材料浓度达到所测得的MIC（64 μg·mL-1）时，其菌落数仍远大于 300 CFU，为多不可计，同时 32 μg·mL-1、16 μg·mL-1组也为多不可计，但比 64 μg·mL-1组更为密集。阴性对照组菌落数在乘100倍后明显较实验组菌落密集。但64 μg·mL-1环丙沙星组未见任何菌落。因此，此实验表明GO-Ag对于沙门氏菌具有一定的抗菌作用，且与其浓度有关，但其抗菌效果不及环丙沙星（见图3）。

图3 平板菌落计数结果

3 讨论

目前众多研究表明GO-Ag具备优良的抗菌性能，且不会诱导产生耐药性，已有研究结果显示GO-Ag对G-大肠杆菌和G+金黄色葡萄球菌均具有较好的抗菌性能，且对前者的抑菌作用大于后者[5]。DE 等[6]研究发现 15 μg·mL-1的 GO-Ag 分别作用于大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌2 h和4 h就能完全杀死细菌；JAWORSKI等[7]同样报道了GO-Ag作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，24 h后其活性分别降低了88.6%、79.5%和76.5%；秦静等[8]研究表明 GO-Ag 浓度为40 μg·mL-1时可完全抑制大肠杆菌的生长；蒋佳佳等[9]研究表明GO-Ag对大肠杆菌具备优越的抗菌性能，测得的MIC 为 5 μg·mL-1；唐佳[10]研究表明 GO-Ag 纳米复合物对大肠杆菌的 MIC 为 4 μg·mL-1。

本研究结果显示，GO-Ag能抑制沙门氏菌生长的最低浓度为64 μg·mL-1，而蒋佳佳以及唐佳研究中所报道 GO-Ag 对大肠杆菌 MIC 分别为 5 μg·mL-1、4 μg·mL-1，结果相差 10 倍以上。这表明 GO-Ag 对沙门氏菌的抗菌作用远远弱于大肠杆菌，在G-菌中各种细菌对GO-Ag的敏感性均不一样。笔者认为结果之间的差异除了与使用的测量方法不同而存在误差外，更多的可能是细菌种属因素导致了如此大的差异。此外，笔者利用测得的MIC做抑菌实验时得到的抑菌效果不理想，且在同等浓度下，GO-Ag的抗菌能力远远不及环丙沙星。这一结果表明GO-Ag对于猪霍乱沙门氏菌的抗菌性能较弱，其在临床上的应用效果相对于传统抗生素而言不存在药效上的优势。

本实验研究结果尚存在一定的局限性。此实验仅使用一株沙门氏菌进行GO-Ag抗菌实验，在一定程度上代表性较差，对于客观地体现出GO-Ag对沙门氏菌的抗菌性能存在一定的偏差。

通过此次实验结果可看出GO-Ag对于沙门氏菌确实具有一定的抑菌性能，但作用相对来说较弱，且GO-Ag作为一种复合材料其稳定性以及对于机体毒性方面都是一个尚待解决的问题。因此，对于GO-Ag未来运用于临床仍需要克服许多问题，如进一步提高GO-Ag的抗菌性能及其结构的稳定性、减少其在人体中的毒性等。

4 结论

综上，本研究结果显示GO-Ag对市场猪肉中分离得到的沙门氏菌具有一定的抗菌性能，测得的MIC 为 64 μg·mL-1，为临床上治疗沙门氏菌引起的疾病提供了一个新的思路，但其抗菌效果与临床上常用的抗沙门氏菌抗生素环丙沙星存在较大的差距，从而在一定程度上限制了其在临床上防治沙门氏菌病的应用。