陈晓嘉，陈 茹，韦 誉，贝荣廷，周芳梅，冯志强

（1.广东省食品质量监督检验站，广东广州 510000；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 510000；3.江苏广海检验检测有限公司，江苏南通 226121）

兽药残留指动物产品的任何可食部分所含兽药母体化合物或其代谢物，以及与兽药相关的杂质残留。近年来食品中兽药残留成为食品安全领域的热点和焦点[1-7]。在我国，滥用、乱用限制使用的药物、非法使用禁止使用的药物的现象屡禁不止，喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑类等化合物在水产养殖方面使用较多，药物滥用易造成水产品污染，通过食物链可在人体内蓄积并具有使人体产生抗药性等副作用的可能性。因此，对抗生素的残留进行监测对促进水产品食品安全具有极其重要的意义[8-15]。

我国发布了多项法规以规范兽药规范使用，也明确水产品中兽残及其代谢物的检出限量范围。目前有近百种兽药在水产养殖行业中使用[16]，其性质各异，国家标准方法多以化学结构类似的同族化合物进行分析方法开发，对同一水产品样本中的兽药残留目前没有合适标准方法进行同步快速筛查[17]。在现有相关的多种兽药残留分析方法中，存在前处理步骤较多、分析时间较长、基质涵盖较小等局限性。基于此，本研究建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法对鱼、虾等水产品中喹诺酮类、磺胺类、硝基咪唑类3大类46种兽药的高通量检测技术，提高了多残留兽药的检测效率，可以满足水产品中多种类兽药风险筛查及监测工作的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水产品：鱼、虾，采购于市场。

试剂：甲醇（LC-MS，Honeywell）；乙酸铵（HPLC，阿拉丁）；乙腈（HPLC，CINC）；甲酸（LC-MS，ACS）；正己烷（HPLC，Honeywell）；冰乙酸（分析纯，康科德）；C18（40～ 60 μm，60Å，艾杰尔）；PSA（40～60 μm，60A，艾杰尔）；无水硫酸钠（分析纯，广州化学试剂厂）；0.22 μm滤膜（艾杰尔）；超纯水（Milli-Q）。

标准品：46种化合物（17种喹诺酮类、24种磺胺类、5种硝基咪唑类）的标准品生产于Tmstandard、Dr.Ehrenstorfer、Bepure、CATO、First Standard、ANPEL，纯度为86.5%～100%。

1.2 仪器与设备

AB Sciex Triple Quad 5500 超高效液相色谱质谱联用仪（AB公司）：配有电喷雾（ESI）离子源；超声仪（新芝生物科技）；涡旋振荡器（heidolph）；高速冷冻离心机（Hettich）；氮吹仪（睿科仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

单标储备液：精密称取标准品1.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，配制为100 μg·mL-1单标储备液，置于 -18 ℃保存。

混合标准中间液：移取储备液，用甲醇逐级稀释成 10.0 μg·mL-1混合标准中间液。

标准曲线：移取混合标准溶液，用空白基质提取液配制成 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1系列浓度标准溶液。

1.3.2 样品前处理

取适量可食部分，绞碎，均质，称取均质样2.0 g于离心管中，加4 g无水硫酸钠，加入1%乙酸乙腈溶液8 mL，涡旋30 s，冰水浴超声提取20 min，10 000 r·min-1离心 3 min，转移上清液，再次往样品加入8 mL1%乙酸乙腈，重复提取，转移上清液并进行合并，水浴40 ℃氮吹至近干，加入1 mL20%甲醇水溶液，涡旋1 min，加入50 mg PSA和 50 mg C18，10 000 r·min-1离心 3 min，过 0.22 μm滤膜过滤。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；进样量：2.0 μL；流速：0.2 mL·min-1，柱温箱：40 ℃；流动相：0.1%甲酸-2 mmol·L-1乙酸铵溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 洗脱梯度

（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）；MRM模式；气帘气30.0 psi；碰撞气：9 psi；离子化电压：4 500 V，源温度：550 ℃；雾化气压力、辅助加热气压力均为55 psi。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本 文 考 察 了 色 谱 柱 C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 和 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）对目标化合物分离度的影响。RP18柱对化合物磺胺类同分异构体的分离度较C18柱和T3柱差，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪没有完全分离；T3柱对磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶的分离优于C18柱。同时硝基咪唑、喹诺酮类在T3柱上均具有较好的分离效果。最终选择色谱柱 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）为分析色谱柱，见图1。

图1 不同色谱柱中3种磺胺的分离情况

2.2 质谱条件的优化

将1.0 ng·mL-1标准溶液直接注入串联质谱仪，根据46种化合物相对分子质量及其带电方式，进行一级质谱全扫描，得到母离子峰。对离子源电压及喷雾气压进行调整至各化合物响应值稳定后，对母离子进行二级质谱扫描，得到46种化合物的子离子碎片信息，同时优化碰撞能量及RF透镜电压，选取2个特征离子进行分析，得到最优的质谱参数，优化参数见表2。

表2 46种化合物质谱参数

（续表2）

（续表2）

2.3 C18和PSA的优化

实验考查C18、PSA及C18和PSA联合使用对样品净化后回收率影响。QuEChERS常用的净化填料主要有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（Graphitized Carbon Black，GCB）等，GCB主要用于农药残留净化，去除色素，C18主要作用于去除基质中脂肪干扰物，PSA主要作用于去除基质中脂类及糖类物质。本文对比50 mg PSA和50 mg C18的净化效果。结果显示，对于虾中的磺胺类，C18的净化效果整体优于PSA，C18的平均回收率为81%，PSA的平均回收率为69%，C18去除杂质能力更好。鱼、虾中C18和PSA对其他化合物的净化效果相当，采用混合分散固相萃取吸附剂的净化效果更好。最终选择50 mg PSA+50 mg C18作为净化填料。

2.4 线性范围、线性方程及检出限

标准曲线采用基质配标法，46种化合物在2～100 ng·mL-1具有良好的线性关系，相关系数r2均大于0.99。以3倍信噪比为方法检出限，46种化合物的检出限为0.6～6.0 μg·kg-1，结果见表3。

表3 46种目标化合物的线性、相关系数、线性范围及检出限

（续表3）

2.5 加标回收及精密度

对阴性样品鱼进行加标回收实验，加标水平为5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、50 μg·kg-1， 每 个 水 平 6 个 平行，测得鱼中硝基咪唑类的回收率在60%～91%，磺胺类的回收率在60%～119%，喹诺酮类的回收率在60%～110%，相对标准偏差≤7%（n=6），满足要求。

3 结论

本文建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测鱼、虾等水产品食品中磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类中46种兽药残留的分析方法。样品经1%乙酸乙腈溶液提取，加入PSA和C18进行净化，使用T3色谱柱进行分离，可以减少样品杂质的干扰。实验分别对前处理方法、色谱及质谱条件进行了比较和优化，极大地提高了多种兽药残留的检测效率，满足水产品中多种类兽药风险筛查及安全监测的需要。