王玉花，陶文靖，田秀梅，石 磊，梁启美，韩 冀*

（1.通标标准技术服务（青岛）有限公司，山东青岛 266071；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

沙门氏菌是最常见的人畜共患病病原菌，会使人和动物出现胃肠炎和败血症等症状[1]。近年来，随着我国宠物行业的快速发展，人们与宠物的关系越来越密切，宠物作为沙门氏菌宿主导致人类感染的风险也日益引起关注。美国疾病控制中心发现，在28例沙门氏菌感染病例中有13人曾在患病前8天内接触过啮齿动物[2]。宠物感染沙门氏菌的主要渠道是进食被污染的宠物食品和水，其中宠物食品在加工过程中，容易受到原料及添加剂的污染。WONG等[3]对新西兰市场销售的宠物咬胶进行了沙门氏菌检测，结果发现新西兰、中国、泰国和澳大利亚等各国产品中沙门氏菌的检出率分别为6.7%、4.1%、3.7%和14.0%。史思等[4]调查了6家宠物食品加工企业的176份宠物食品，其中半成品沙门氏菌阳性率为7.55%，成品中阳性率为0.81%。秦超等[5]汇总分析了2012—2020年欧盟食品和饲料快速预警系统（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）中的饲料通报，RASFF共通报了188起宠物食品中检出沙门氏菌的不合格情形，其中包括来自中国的犬猫饲料、狗咬胶和鱼饲料等。

传统的沙门氏菌检测方法有微生物分离纯化、生化鉴定等[6]，其检测周期长、检测过程复杂、无法适应快速检测的需求。实时荧光PCR技术的迅速发展为快速准确地鉴别宠物食品中的沙门氏菌提供了技术支持，但沙门氏菌类群繁多，需要筛选合适的引物及探针，同时宠物食品的成分复杂，需要寻找合适的样品前处理方法，本研究拟建立了一种适合于宠物食品中沙门氏菌污染检测的实时荧光PCR方法。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、 肠 炎 沙 门 氏 菌（Salmonella enteritidis）CMCC50335、 伤 寒 沙 门 氏 菌（Salmonella typhi）CMCC50071、 婴 儿 沙 门 氏菌（Salmonella infantis）CICC21482、 肯 塔 基 沙门 氏 菌（Salmonella kentucky）CICC21488、 大 肠杆 菌（Escherichia coli）ATCC8739、 福 氏 志 贺 氏菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 副 溶 血 性 弧菌（Vibrio para）ATCC17802、 单 增 李 斯 特 氏 菌（Listria monocytogenes）ATCC19115、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027、 产 气 肠杆菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC4352、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC11778、粪肠球菌（Enterococcus faecium）ATCC8459和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）ATCC14041。

1.2 试剂和设备

LRH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Stepone plus实时荧光PCR仪，美国ABI；VORTEX3涡旋振荡器，德国IKA；5424离心机，德国Eppendorf；BSC-1360-LIIB2生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；AL204-IC电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix，美国Thermo Fisher；缓冲蛋白胨水（BPW），北京陆桥技术股份有限公司；引物及探针合成，英潍捷基（上海）贸易有限公司，见表1。

表1 沙门氏菌PCR引物和探针

1.3 实验方法

1.3.1 细菌基因组DNA提取

上述实验菌株分别挑取一环接种至NB肉汤培养基中，37 ℃过夜培养后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用核酸蛋白仪测定其纯度和浓度，提取后的模板DNA保存于-20 ℃备用。

1.3.2 沙门氏菌实时荧光PCR反应体系和反应条件

PCR反应体系总体积为20 μL：2X TaqMan Gene Expression Master Mix 为 10 μL；引物 F（10 μmol·L-1）为 1 μL； 引 物 R（10 μmol·L-1）为 1 μL； 探 针 P（10 μmol·L-1）为 1 μL；DNA 模板为 4 μL；ddH2O 补齐至 20 μL。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性 15 s，60 ℃退火 60 s，同时 FAM通道采集荧光信号，40个循环。

1.3.3 实时荧光PCR方法特异性验证

提取5株沙门氏菌和10株非沙门氏菌DNA后，使用实时荧光PCR法检测其特异性，验证本研究建立的沙门氏菌PCR检测方法的特异性，同时用无菌去离子水作空白对照。

1.3.4 宠物食品人工污染沙门氏菌的检测

取4份全价营养猫粮各25 g，向其中添加鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028稀释菌液，添加浓度分别为 1.9 CFU/25 g、9.5 CFU/25 g、19.0 CFU/25 g和95.0 CFU/25 g，加入225 mL灭菌BPW，同时做样品的本底测试，振荡混匀后36 ℃培养过夜，通过实时荧光PCR方法检测沙门氏菌。

1.3.5 传统微生物法与实时荧光PCR法的比较

根据产品形态划分，宠物食品主要分为湿粮和干粮两大类别，干粮分为低温烘焙粮、高温膨化粮、冻干粮和风干粮等；湿粮可分为罐头和鲜食等。分别使用国家标准《饲料中沙门氏菌的测定》（GB/T 13091—2018）[7]与实时荧光PCR法对表2中所列宠物食品各品类共37个样品中的沙门氏菌进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR方法特异性

采用实时荧光PCR法对5株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行检测，5株沙门氏菌均有典型S型扩增曲线，而10株非沙门氏菌及空白对照均未产生扩增曲线，结果见表2。

表2 实时荧光PCR法检测沙门氏菌的结果

2.2 宠物食品人工污染沙门氏菌的检测

对4份全价营养猫粮进行人工污染实试验后，通过实时荧光PCR方法检测其中的沙门氏菌，结果表明，全价营养猫粮本底未检出沙门氏菌，而各浓度污染样品扩增后均可见典型S型扩增曲线，表明该方法检测沙门氏菌的灵敏度可达到1.9 CFU/25 g，结果见图1。

图1 人工污染沙门氏菌样品检测

2.3 传统微生物法与实时荧光PCR法的比较

选择宠物食品各品类共37个样品，模拟污染鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028后，采用《饲料中沙门氏菌的测定》（GB/T 13091—2018）传统微生物学法进行沙门氏菌的检测，同时取BPW增菌液提取DNA后进行沙门氏菌实时荧光PCR检测。37份模拟污染宠物食品样品均检出沙门菌，详见表3，检测结果与传统微生物法一致。

表3 两种检测方法的检测结果

3 结论与讨论

近年来，由宠物引发人类感染沙门氏菌的事件逐渐增多，已成为值得关注的健康问题，应高度重视和预防宠物在感染事件发生及扩散中的负面作用。而宠物的沙门氏菌感染与所进食的宠物食品中的沙门氏菌污染有直接的关系[8]，沙门氏菌能通过被污染的食品、饲料感染人和动物，陈沁等[9]报道498份进口的动物源性饲料沙门氏菌阳性率为4.62%，周春红等[10]对95份饲料进行沙门氏菌分离时，检出阳性率为5.26%，这也要求企业在宠物食品加工过程中对沙门氏菌应进行有效防范，从源头断绝沙门氏菌的污染可能。

目前宠物食品中沙门氏菌主要通过细菌分离、生化鉴定等传统微生物学手段进行检测，存在检测周期较长、检测过程烦琐的弊端，无法适应快速检测的要求，同时对可疑菌落的选取存在主观判断性，容易出现漏检，对检测人员技术水平要求较高。而比较成熟的快速检测沙门氏菌的方法有免疫学检测技术[11]、分子生物学技术[12]、电化学检测方法[13]和生物传感器检测技术[14]等，研究对象主要是食品样品中的沙门氏菌检测，而对宠物食品中沙门氏菌快速检测方法的报道较少，本研究针对宠物食品特殊基质，优化了沙门氏菌的测试流程，采用实时荧光PCR法检测，降低了试验过程中因操作步骤复杂引起的误差，与传统的微生物法相比，具备良好的稳定性与准确性。本研究检测沙门氏菌的灵敏度可达到1.9 CFU/25 g，与贾俊涛和张秀芹等的研究结果一致[15-16]。研究同时表明，建立的实时荧光PCR方法和传统微生物法检测结果符合率为100%，可以推广运用于宠物食品中沙门氏菌的快速检测。