吴 曼，孟翠萍，梁海燕，杨丽玉，吴 琪，慈敦伟，郑永美，李新国

（1青岛科技大学化工学院/清洁化工过程山东省高校重点实验室，山东青岛 266042；2青岛科技大学图书馆信息中心，山东青岛 266042；3山东省花生研究所/国家花生工程技术研究中心，山东青岛 266100；4山东省农业科学院生物技术研究中心，济南 250100）

0 引言

在农业生产发展中，根瘤菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性杆菌[1-2]，可与豆科植物形成共生固氮体系，在提高农作物产量的同时，不会对周围生态环境带来污染，该共生体系的固氮作用一直是众多科研人员研究的热点[3-4]。在生物固氮体系中，根瘤菌与豆科植物的共生体系占有重要位置，约占生物固氮总量的65%以上[5]。豆科作物与根瘤菌进行共生固氮作用所产生的氮素，一方面可以满足自身对氮素的需求，另一方面还可将多余的氮素提供给与其间作或者轮作的作物，深入研究根瘤菌固氮体系对中国农业的可持续发展具有重要意义[6-9]。

探究根瘤菌固氮研究现状，分析存在问题及提出未来发展方向，可为豆科作物高效绿色优质生产及产业提质增效发展提供重要依据。笔者利用文献计量学方法[10-14]，基于Web of Science核心合集和CNKI期刊数据库，对国内外根瘤菌固氮研究的文献数量、国家、出版刊物及研究内容等进行统计分析，并采用CiteSpace V可视化软件进行研究热点预测和分析，客观呈现根瘤菌固氮的研究现状，以期为相关研究人员及时掌握根瘤菌固氮的研究态势提供数据参考。

1 数据来源与统计方法

1.1 数据来源

以Web of Science数据库核心合集和中国知网(CNKI)的学术期刊全文数据库为文献数据源，英文检索式为“主题=(Rhizobia)AND主题=(Nodule nitrogen fixation)”，文献类型为Article and Review；中文检索式为“主题=（根瘤菌）并含主题=（根瘤固氮）”；选取1980—2020年根瘤菌研究的中英文文献作为基础数据，将 1980—2020年分为1980—1989、1990—1999、2000—2009、2010—2020年4个时间段进行检索，检索日期为2020年9月10日。经过筛选，删除与主题词无关的文献，最终得到英文文献3530篇和中文文献3848篇，以此作为分析样本进行文献统计和数据挖掘。

1.2 统计方法

利用引文网络分析工具CiteSpace V进行文献基础数据挖掘和可视化分析[15]，绘制根瘤菌研究的知识图谱，通过关键词、主题词等功能选择分析国内外根瘤菌研究的热点和前沿。在进行关键词共现分析之前，对关键词进行聚类，使用LLR算法提取研究前沿术语，再对聚类词进行Timeline分析。时间段为1980—2020年，时间切割设为1年，术语来源选取标题、摘要、关键字，节点类型为关键词，阈值设置为top=50[16]。

2 文献分析

2.1 根瘤菌固氮研究的进程分析

如图1所示，1980—2020年近40年根瘤菌研究的中文期刊论文共发表3848篇，发文量随时间变化较小，整体呈波浪上升趋势，在2009—2014年间发文量较多。而WOS核心合集数据库显示，根瘤菌的英文文献共3530篇，在1990年之前根瘤菌方面的研究文献发表数量较少，从1990年开始发文量增多，并在1990—2010年呈稳定趋势，而从2010年之后发文数量又开始增多，2010—2020年发文量占40年间总发文量的42.38%。

图1 1980—2020年国内外根瘤菌固氮研究论文数量动态

2.2 根瘤菌固氮研究的发文机构分析

CNKI数据库结果显示，近40年国内发表20篇及以上根瘤菌研究文献的科研单位有28个，包括18所高校和10所科研院所。发文量最多的科研机构为中国农业科学院土壤肥料研究所，发文138篇；发文量最多的高校为华中农业大学，发文133篇。这些研究机构主要集中在国内农业及学术力量雄厚的省份，如北京、江苏、黑龙江、沈阳等。基于专业优势，农业、农林类研究机构及高校是根瘤菌研究的活跃机构，属于国内该领域发文的领军团体。将1980—2020年划分为4个10年期，发文量排名前10位的中国机构如表1所示。可以看出在1980—1989年间根瘤菌研究的科研机构主要以科研院所为主，发文量排名前10位的研究机构仅有3所为高校。但到2000—2009、2010—2020年间，发文量排名前10位的研究机构仅有1所和2所来自科研院所。

表1 CNKI数据库中根瘤菌研究发文量前10位的中国科研机构随时间分布

WOS数据库结果显示，国内外共有1228个机构发表了根瘤菌方面的研究文献，分布较为广泛。美国、法国和英国是在该研究领域发文量和被引频次最多的3个国家。如表2所示，发文量超过50篇的机构有20个，其中发文量前20位的机构中，有9所来自法国、5所为美国科研机构，来自中国的科研机构仅有1所。

表2 WOS数据库中根瘤菌研究发文量前20位的科研机构

续表2

2.3 根瘤菌固氮研究的文献来源

对根瘤菌固氮研究领域发文量和被引频次的期刊分析，可以帮助研究学者快速把握该领域研究的核心期刊，以作为科研成果查找、收集及论文投稿期刊选择的重要参考。在WOS数据库中，根瘤菌固氮方面的研究文献共发表在517个国际期刊上，发文数量前10位的期刊如表3所示。载文量多于1篇的期刊有90种，累计载文量2179篇，占总文献的61.7%。发文量前20位的期刊中，来自美国的有8种、荷兰有4种、德国和英国各有3种。发文量前3位的期刊分别为《Plant and Soil》（179 篇）、《Molecular Plant-Microbe Interactions》（166篇）和《Journal of Bacteriology》（93篇），这些也是该领域被引频次最高的前3位期刊，其中，《Molecular Plant-Microbe Interactions》发文的被引频次最高为5800次。这些在根瘤菌固氮方面的高发文量期刊亦为该研究领域的潜在投稿期刊，同时这些也是根瘤菌固氮方面影响力相对较大的期刊。另外，《Nature》虽然发文量只有4篇，但其被引频次为935次，这一方面与其发文时间较早有关，另一方面也与期刊的高影响力有关。

表3 WOS数据库中根瘤菌研究发文量前10位的期刊

CNKI数据库中在根瘤菌研究方面发文量最多的前3位期刊分别为《中国农业科学》（68篇）、《华中农业大学学报》（63篇）和《草业科学》（36篇），如表4所示。发文量超过10篇的期刊有13种。对比研究这些期刊可知，对根瘤菌方面的研究文献主要发表在农业类的专业学术期刊中。就论文被引频次来看，被引频次最高为288次，为陈文新等[14]2004年的一篇研究成果《根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系》。

表4 WOS数据库中根瘤菌研究发文量前10位的期刊

2.4 国内外根瘤菌固氮研究热点

2.4.1 国内根瘤菌固氮研究热点网络图谱特征 近40年国内发表根瘤菌固氮研究相关的文献共检索到3848 篇 ，1980—1989、1990—1999、2000—2009、2010—2020年4个10年期发文量分别占总发文量的22.7%、21.2%、24.8%和31.2%，显示出近40年国内研究学者对该研究领域的持续关注。关键词是论文研究的核心词汇和主题概念，利用CiteSpace软件生成的知识图谱可以较好地反映关键词在文献中出现的频次和关键词间的关联，在一定程度上体现根瘤菌固氮研究的主要重点和热点领域。分不同时间段，对过去40年间国内根瘤菌固氮方面的研究文献进行关键词共现和聚类分析，获得高频关键词如表5所示。一般认为，关键词出现频次高、中心性强的为研究热点[16]。根瘤菌作为本研究的主题词，具有最高的关键词出现频次，1980—2020年间排名前10位的关键词分别为大豆、共生固氮、紫花苜蓿、产量、生物固氮、大豆根瘤菌、固氮能力、固氮酶、花生等，这些也是国内根瘤菌固氮方面的关注热点和主要内容。这些研究热点形成了以#0大豆、#1大豆根瘤菌、#2固氮酶、#3沙打旺、#4鼓粒期等为标签，相互作用，紧密关联的聚类，这些聚类标识了该研究领域的知识基础结构。在1980—2020年的近40年间出现频次排名前20位的关键词中除“花生”初现年为1991年，“豆科植物”初现年为1994年外，其他关键词的初现年均为1980—1990年，表明对根瘤菌固氮的研究内容和研究热点还是较为固定，主要集中在大豆、花生、苜蓿等根瘤菌固氮植物的基因遗传、生理期、高产栽培等的固氮机理、固氮能力提升及栽培技术等方面。

表5 国内根瘤菌固氮研究不同年限前10位高频关键词

将1980—2020年划分为4个10年期，CNKI数据库中根瘤菌固氮国内文献关键词聚类图如图2所示。1980—2020年间4个10年期所发表文献中出现频次排名前10位的关键词较为稳定，主要为根瘤菌、固氮酶、共生固氮、固氮活性、大豆根瘤菌、生物固氮、固氮作用、增产作用、根瘤菌剂、根瘤菌接种等。1980—1989年文献中的关键词形成了以#0固氮作用、#1共生固氮、#2根瘤菌剂、#3增产效果、#4快生型大豆根瘤菌、#5作物吸收、#6土壤养分、#7有效分枝、#9稳产高产、#10根瘤内生菌等为标签，相互作用、紧密关联的10个大聚类。1990—1999年根瘤菌固氮研究文献中的关键词形成了以#0高产栽培技术、#1结瘤基因、#2固氮量、#3花生、#4大豆根瘤菌、#5固氮酶活性、#7生态学研究、#8数值分类等为标签，相互作用、紧密关联的8个聚类。2000—2009年的文献关键词形成了以#0 DNA-DNA杂交、#1结瘤、#2合理密植、#3固氮菌剂、#4AM真菌、#5筛选、#6数值分类、#7根瘤、#8 RAPD、#9脉冲场电泳、#12红壤性水稻土、#13筛选等为标签，相互作用、紧密关联的聚类。2010—2020年则形成了以#0结荚期、#1紫花苜蓿、#2遗传多样性、#3共生固氮、#4大豆、#5蚕豆、#6小g蛋白、#7化肥用量、#8高通量测序、#9固氮、#10多样性、#11酸性土壤等为标签，相互作用、紧密关联的12个聚类。

图2 1980—2020年4个10年期CNKI数据库中根瘤菌固氮国际文献关键词聚类图

在2000—2009年，随着基因工程及DNA重组技术的发展，对极端环境下根瘤菌工程菌株的研发应用、基因微观水平的机理探讨受到学者的广泛关注，以“DNA-DNA杂交”为标签，防沙治沙、生物型种衣剂、共生固氮体系、耐碱、固氮活性、胞外多糖(EPS)、16S rDNA序列、菌剂等的关键词聚类成为最大的聚类群。在近40年根瘤菌固氮研究文献中关键词出现频次中，初现年在2010—2019年间且排名前10位的关键词分别为需肥特点、大豆苗期、技术、无公害、土壤微生物、大豆食心虫、氮肥、大豆种植、栽培、田间管理。随着人们对食品安全的重视，对无公害绿色食品的研究热度进一步提升。

2.4.2 国际根瘤菌固氮研究热点网络图谱特征 近40年国际发表根瘤菌固氮研究相关的文献共检索到3530 篇 ，1980—1989、1990—1999、2000—2009、2010—2020年4个10年期发文量分别占总发文量的0.57%、28.8%、28.3%和42.4%，显示出近40年全球研究学者对该研究领域关注程度的持续升温。由于1980—1989年论文数量较少，分不同时间段对1990—2020年间国际根瘤菌固氮方面的研究文献进行关键词共现和聚类分析，获得高频关键词如表6所示。“Nitrogen Fixation”作为本研究的主题词，具有最高的关键词出现频次，1990—2020年间排名前10位的关键词分别为nitrogen fixation、nodulation、rhizobium、root nodule、legume、symbiosis、rhizobia、nodule、strain、Bradyrhizobium japonicum等，这些也是国际根瘤菌固氮方面的关注热点和主要内容。这些研究热点形成了以 #0 crop rotation、#1Escherichia coli、#2Lotus japonicus、#3 mlsa、#4 nodule、#5 alphaproteobacteria、#6 soil microorganism、#7 insect tolerance等为标签，相互作用，紧密关联的聚类，这些聚类标识了该研究领域的知识基础结构。在1990—2020的近30年间出现频次排名前20位的关键词初现年均为1990—1989年，表明国内外对根瘤菌固氮的研究内容和研究热点还是较为固定，主要集中在大豆、花生、苜蓿等根瘤菌固氮植物的基因遗传、生理期、高产栽培等的固氮机理、固氮能力提升及栽培技术等方面。

表6 国际根瘤菌固氮研究不同年限前10位高频关键词

根据图3的聚类视图，在1990—1999年发表根瘤菌固氮研究文献中出现频次排名前10位的关键词分别 为 nitrogen fixation、nodulation、rhizobium、root nodule、symbiosis、legume、nodule、Bradyrhizobium japonicum、growth、strain，这些关键词形成了以#0 inoculation、#1 form ineffective nodule、#2 frankia、#3 pea、#4 nitrate reductase、#5 stem nodule、#6 root-nodule bacteria等为标签，相互作用、紧密关联的7个聚类，显示对根瘤菌基因及遗传表达的探究成为研究热点。在2000—2009年发表根瘤菌固氮研究文献中出现频次排名前10位的关键词分别为nitrogen fixation、nodulation、rhizobium、symbiosis、legume、root nodule、rhizobia、strain、nodule、Bradyrhizobium japonicum，这些关键词形成了以#0Escherichia coli、#1 pisum sativum、#2 population、#3 senescence、#4 frankia、#5 calcium、#6 alphaproteobacteria、#7 N contents等为标签，相互作用、紧密关联的8个聚类。在2010—2020年发表根瘤菌固氮研究文献中出现频次排名前10位的关键词分别 为 nitrogen fixation、nodulation、rhizobia、legume、root nodule、symbiosis、rhizobium、medicago truncatula、nodule、biological nitrogen fixation，这些关键词形成了以 #0Lotus japonicus、#1 plant growth promotion、#2 bradyrhizobium、#3 soybean、#4 partner choice、#5 rootnodule bacteria等为标签，相互作用、紧密关联的6个聚类。在近30年根瘤菌固氮研究文献中关键词出现频次中，初现年在2000—2009年间且排名前10位的关键词分别为Lotus japonicus、stress、arabidopsis、saltstress、nitric oxide、genome、Phaseolus vulgarisL.、mutualism、rhizosphere，显示作物与豆科植物联合耕作，及对根基微环境的研究热度进一步提升。初现年在2010—2020年间且排名前10位的关键词分别为root-nodule bacteria、alphaproteobacteria、multilocus sequence analysis、drought、Burkholderia phymatum、region、annotation、co-inoculation、symbiotic efficiency，显示对干旱等极端环境下根瘤菌的基因及宏观研究热度进一步提升。

图3 1990—2020年3个10年期WOS数据库中根瘤菌固氮国际文献关键词聚类图

3 结论与讨论

笔者以Web of Science核心合集和CNKI期刊数据库为基础数据来源，基于文献计量学及CiteSpace V分析，对根瘤菌固氮研究的年代分布、出版刊物、研究内容及热点等做了全面的比较分析。研究结果显示，1980—2020年根瘤菌固氮方面的研究较为稳定，与此相匹配的根瘤菌固氮研究论文数量也呈波动上升趋势。中国发文机构中占半数的为农业及农林类高校和科研单位，主要集中在中国农业及学术力量雄厚的省份，如北京、江苏等，而国际合作是提高科研成果产出水平的有效途径。

基于WOS和CNKI数据库所收录研究文献分析，根瘤菌固氮对减少工业氮肥的生产及施用，建立氮素生态平衡和农业可持续发展发挥着重要作用[17]。根瘤菌固氮效率与根瘤菌菌株、豆科植物种类和土壤生境的关系已取得重要研究进展[18-22]，提高根瘤菌固氮效率依然是当前和今后的研究热点。结合对研究文献关键词的分析结果，对根瘤菌固氮的研究主要有：（1）施肥对根瘤菌固氮的影响。豆科植物可与根瘤菌形成共生固氮体系，利用大气中的氮气作为氮源，部分替代氮肥，生产中仍需要施用一定的氮肥，若氮肥施用过量，则不利于根瘤菌的侵染结瘤，降低根瘤菌固氮效率，因此适时适量施用氮肥，可较好地促进豆科植物根瘤菌固氮潜力的发挥，提高根瘤菌固氮能力及促进植物的生产[23-28]。配合施用适量的有机肥和微肥，不仅可以促进根瘤菌的生长繁殖，改变菌体形态及表面结构，减弱宿主植物的防御反应，促进根瘤菌的侵染以及运移和定殖，还可以提供根瘤菌固氮反应过程中所需重要物质成分，有效提高根瘤菌固氮效率[29-35]。（2）根瘤菌接种效应。根瘤菌和宿主之间存在专一性，一种根瘤菌只能侵染一种或几种豆科植物并生成根瘤，不能成功侵染其他豆科植物。根瘤菌种质资源丰富，但是与指定豆科植物匹配优良的根瘤菌较少，筛选出优良高效根瘤菌是接种根瘤菌的重要前提工作。接种高效根瘤菌剂（株），可以显著增加根瘤数量和质量，提高根瘤内豆血红蛋白含量和固氮酶活性，增强根瘤菌固氮能力[36-42]。（3）豆科植物与禾本科植物间套作对根瘤固氮的影响机理。间套作系统内植物通过根系分泌物质及物理接触对土壤生境做出化感应答，根系形态性状及对营养元素的吸收利用发生改变。禾本科植物对氮素营养的高量需求可以缓解豆科植物根瘤的“氮阻遏”作用，增强根瘤菌侵染结瘤能力，增加根瘤数量[43-45]。间套作中铁高效的植物如玉米、大麦、高粱等分泌的麦根酸通过间作可以改善豆科植物（如花生和大豆）的铁营养，满足根瘤菌固氮酶、豆血红蛋白及铁氧还蛋白对铁元素的需求，增强根瘤菌固氮酶活性，进而提高根瘤菌固氮能力[46-51]。

现阶段，国内外在根瘤菌固氮研究方面取得了一定程度的进展，但仍需进一步完善，可从以下方面展开：（1）加强基础理论研究。开展根瘤菌与豆科植物共生固氮的信号传递及相互作用的分子机理研究，构建根瘤菌基因图谱，有针对性地进行根瘤菌的遗传改造，培育高效固氮的根瘤菌菌株，扩大根瘤菌宿主范围和提高根瘤菌固氮效率。（2）筛选和培育根瘤菌高效固氮植物品种。国内豆科植物上千种，不同豆科植物间及同种豆科植物不同基因型间根瘤菌固氮能力存在显著遗传变异性，可以从现有的豆科植物种质中选择和培育根瘤菌高效固氮优良品系。（3）加强根瘤菌剂的接种应用。根瘤菌剂接种技术不稳定和根瘤菌剂固化工序较为繁琐，国内豆科植物根瘤菌剂接种面积微不足道。优化和创新根瘤菌剂接种技术，选用适宜的载体将根瘤菌剂接种于土壤中，不仅减少土壤生境对根瘤菌常规繁殖的影响，增加土壤中根瘤菌数量，而且可以促进整个根系部位的根瘤菌侵染结瘤和提高根瘤菌固氮潜力。（4）优化施肥技术，按需供肥。氮肥对根瘤菌固氮的影响首当其冲，在根瘤形成初期，需要低水平的氮素营养启动根瘤菌固氮，若氮水平过高，则容易抑制根瘤菌的侵染结瘤。根据豆科植物需氮特性，合理施用缓/控释氮肥或施用追肥，既可以满足豆科植物对氮素的需求，还能够避免根瘤菌固氮前期因氮营养水平过高对固氮作用带来的不利影响。根据豆科植物土壤质量，可适当增施有机肥和补施微肥，有机肥可以有效提高土壤生境中根瘤菌数量，微肥钼和铁是根瘤菌固氮酶和类菌体中豆血红蛋白和铁氧还蛋白等物质的重要成分，可以有效提高根瘤菌固氮效率，减轻和缓解豆科植物对工业氮肥的依赖，实现绿色生态农业。