陈敏娜，李春兰，刘 静，*

(1．汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺内科，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院广东省乳腺癌诊治研究重点实验室/长江学者实验室/生理学教研室，广东 汕头 515041)

在人体中，基因表达的调控是一个复杂而严谨的过程，其中转录水平的调控是极其重要的一环，也是分子生物学研究的重要内容。目前双荧光素酶报告基因系统是转录水平调控研究重要的实验方法。通过对启动子序列和活性的分析，验证启动子结合元件的反式激活能力，进而验证基因之间的转录调控关系[1]。

乳腺癌现已超过肺癌，成为全球最常见的恶性肿瘤。而作为体表肿瘤，乳腺癌的转移是患者因癌症死亡的主要原因[2]。根据文献报道，在发育的乳腺中，催乳素(prolactin，PRL)所介导的PRL-JAK2-STAT5A是较经典的调控分子通路，可以调控乳腺发育、增殖、分化、泌乳等重要功能[3-4]。在催乳素的刺激下，持续表达活化的STAT5会抑制乳腺退化并促进乳腺肿瘤的形成，多认为其是原癌基因[5-6]，但在乳腺癌患者中，STAT5的表达却是影响乳腺癌患者预后的独立因素[6-8]。乳腺癌转移进展的过程会伴随STAT5活化形式的丢失和/或转录水平下调[9-10]。Sultan等[9]发现催乳素激活STAT5表达可以抑制迁移侵袭，同时增加细胞表面黏连蛋白E-cadherin，但是对细胞总的E-cadherin的表达并无影响。研究表明，STAT5A活化在抑制乳腺癌的侵袭和转移过程中起到重要作用，并预示患者良好的预后[9-10]。

构建可以有效监测STAT5A启动子活性的平台，将有利于研究STAT5A在乳腺癌中的转录调控机制。本研究组通过启动子序列分析发现STAT5A启动子部位存在Notch信号通路的结合序列，即CSL结合位点TGGGAA或GTGGGAA。因此，为进一步研究Notch信号通路是否在转录水平调控STAT5A的表达，我们构建STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒，以及仅包含Notch结合序列的荧光素酶报告基因质粒，并进行双荧光报告基因实验，验证构建质粒的有效性。

1 材料与方法

1.1材料

DNAzol(D104-01)购于北京康润诚业生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒(#P214-03)、质粒小提试剂盒(DP103)、无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)购于天根生化科技(北京)有限公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ、E.coliCompetent Cells DH5α购自TaKaRa公司；Thermo T4 DNA Ligase试剂盒(#EL0011)购于Thermo公司；载体质粒pGL3-Enhancer(图1)及Dula-Luciferas Reporter Assay system试剂盒购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1 人乳腺癌MCF7细胞基因组DNA提取 MCF7细胞购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，使用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基(Gibco公司)培养于35 mm培养皿，适时更换培养基。当细胞汇合度达90%时，予PBS清洗后，按DNAzol说明书提取MCF7细胞的基因组DNA，作为扩增模板。使用核酸分析仪(Thermo公司)检测所提基因组DNA的浓度及纯度后，置于-80℃冰箱中储存待用。

图1 pGL3-Enhancer质粒图谱(Promega公司)

1.2.2 引物设计 在NCBI上查找STAT5A基因序列，即NC_000017.11，并将其第一个外显子往前2 000 bp的范围视为启动子区域，即本研究的目标序列。应用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物，同时加入正向酶切位点KpnⅠ和反向酶切位点HindⅢ以及相应的保护碱基，所采用的引物序列如下：STAT5A-pro正向，5′-GGGGTACCTCTGATCTTCCTGAACCCCCA-3′；反 向，5′-CCAAGCTTAGAAAAGTCCAGGGAGG GACC-3′。STAT5A-pro-Notch正向，5′-CGGGGTAC CTGCCAAATCCATTGCTCA-3′；反 向，5′-CCCAAG CTTTCTTGCCCCTTACTACCTC-3′。扩增片段长度分别为2 101和287 bp。所设计引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 目的片段扩增 本项目采用可以用于快速PCR扩增的高保真DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase，以MCF7细胞基因组DNA为模板，分别使用STAT5A-pro及STAT5A-pro-Notch引物扩增STAT5A启动子区的目标DNA片段。PCR反应体系见表1，引物在使用前已提前测试并确定最适退火温度，STAT5A-pro引物的最适退火温度为66℃，STAT5A-pro-Notch引物的最适退火温度为54℃，按说明书PCR反应条件进行扩增。然后分别使用1%及3%的琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察并切取正确长度的PCR产物，使用DNA纯化回收试剂盒，按说明书步骤回收DNA。后续可进行下一步操作或储存于-20℃冰箱中。

表1 扩增目的DNA片段的PCR反应体系(50μL)

1.2.4 报告基因质粒的构建 利用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ对上述PCR产物及载体质粒pGL3-Enhancer进行双酶切。反应条件为37℃，酶切1 h；而后转为65℃，维持10 min灭活限制性内切酶。酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段，以除去酶切下的小碎片。回收的DNA片段测浓度后储存于-20℃冰箱中待用。

使用T4 DNA Ligase试剂盒，并按说明书步骤将所得到的目的片段和已行酶切的载体进行连接，目的片段与已酶切载体的物质的量比例为3∶1。连接体系为10×T4 Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 0.2μL，目的片段及已酶切载体，最后加无菌水定容至20μL。

1.2.5 报告基因质粒序列的鉴定 连接反应完成后取上述连接产物5μL加入50μL感受态菌液(E.coliCompetent Cells DH5α)进行转化，转化后挑取单克隆菌落，进行质粒小提提取相应的质粒，并行双酶切反应和直接测序法鉴定正确构建的质粒。选取序列正确的质粒进行质粒大提，再次行双酶切反应以进一步确定质粒，确定后将扩增获取的质粒存储于-20℃待用。

直接测序法由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。所构建成功的质粒根据插入序列的不同，分别命名为pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5Apro-N-luc-E。

图2 目的质粒双酶切结果

1.2.6 报告基因质粒转录活性的检测 本实验选用空载体pGL3-enhance质粒作为阴性对照组，选用能表达萤火虫荧光素酶pGL3-Control作为阳性对照，重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E作为实验组，而表达海肾荧光素酶的pRL-SV40质粒作为内参，将上述两种质粒共同转染至细胞内，以检测两种荧光素酶的活性。

将MCF7细胞接种于24孔板中，于37℃、CO2体积分数为5%条件下培养，增殖至60%左右时，应用Lipofectamine 3000试剂盒转染上述质粒，48 h后按照荧光素酶检测系统方法处理转染细胞，并通过LB9507系统测定荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

实验数据使用SPSS 19.0软件进行分析。重组载体STAT5A-pro-luc-E/pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E与空载体pGL3-Enhancer荧光素酶相对活性的差异分析采用Student'st检验。所有P值采用双侧检测，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT5A启动子报告基因质粒构建成功

通过DNA扩增、酶切、连接、筛选等步骤，获得到pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E两个质粒。双酶切反应结果显示插入目的序列片断长度正确，分别为2 101 bp及287 bp(图2)。进一步测序结果显示，克隆的STAT5A启动子序列与NCBI数据库中信息完全一致，提示插入片段序列正确，质粒构建成功。

2.2 STAT5A启动子报告基因质粒具有启动子活性

在MCF7细胞中共转染pGL3-Enhancer和pRLSV40作为阴性对照组，重组载体pGL3-STAT5A-proluc-E/pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E和pRL-SV40共转染MCF7细胞后，两者的荧光素酶的相对活性分别约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍和6倍(P＜0.01)，而阳性对照pGL3-Control的荧光素酶活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的199倍(P＜0.01)(图3)，提示pGL3-STAT5A-pro-luc-E、pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E报告基因质粒能表达萤火虫荧光素酶，反映构建的STAT5A启动子具有转录活性。

图3 STAT 5A报告基因质粒的转录活性

3 讨论

癌症是全球的公共健康问题，癌症的发病率和死亡率都在逐年增加，也是医学的一个难题。2015年中国癌症统计数据显示，在中国乳腺癌占所有女性癌症的15%，其死亡率也在不断升高[11]。乳腺癌的转移与复发是造成患者死亡的重要原因，肿瘤转移是多个基因共同参与调控的复杂过程。因此，阐明乳腺癌转移的分子机制，可为乳腺癌患者的个体化治疗提供潜在的有效靶点，进而实现预防乳腺癌的复发与转移，提高乳腺癌患者生存率的目的。而转录调控是基因表达调控的一个重要组成，目前双荧光素酶报告基因系统是研究转录调控的重要实验方法，通过对启动子序列的研究，探讨其转录因子的结合靶点，进而在实验中证实转录因子对靶基因的转录作用。

本研究在分析转录因子STAT5A启动子的基础上，利用PCR方法扩增STAT5A启动子序列，并成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E及pGL3-STAT5A-pro-Nluc-E。该系统不仅提供了反应STAT5A启动子活性的报告系统，同时特异性的以致癌因子Notch信号通路为研究对象，构建Notch特异性结合的STAT5A启动子活性的报告系统，为深入研究Notch信号通路的功能奠定了基础，并为以Notch为治疗靶点的小分子药物的筛选提供了高通量筛选平台。

而在乳腺癌细胞MCF7中转染了报告基因质粒后对比阴性对照，两种STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒表达的荧光素酶活性均升高数倍，提示该质粒在STAT5A启动子调控下可以表达荧光素酶蛋白，具有转录活性，为下一步实验奠定了良好基础和技术平台。本项目在双荧光素酶报告基因检测过程中，以pGL3-Enhancer载体表达的萤火虫荧光素酶活性为检测指标，而pRL-SV40质粒表达海肾荧光素酶活性为内参指标，为样品的加样进行了有效的监控[12]。

综上所述，本研究利用分子克隆的技术，以pGL3-Enhancer质粒为载体，成功构建了可以反映STAT5A启动子转录活性的pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶报告基因质粒，以及具有Notch特异性潜在结合的pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶报告基因质粒，为STAT5A转录调控的研究提供了有效的鉴定平台，也为Notch信号通路的研究提供了筛选手段。