李玉凤，张谦华，林雀跃，朱 韬，何颂华，赵立春，*

（1.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.广西壮族自治区食品药品检验所，南宁 530021）

玉叶金花是茜草科植物玉叶金花（Mussaenda pubescensAit.F.）的干燥根及茎，具有清热解毒，利湿消肿的功效[1-2]，常被用于治疗各种炎症并发症，如感冒、咽喉炎、肾炎水肿、支气管炎、肠炎腹泻等，目前市场上的产品有玉叶清火片、玉叶清火胶囊，玉叶解毒颗粒等[3-5]。现代研究发现，玉叶金花中含有多种化学成分，如皂苷类、单萜类、苯丙素类等[5]。本课题前期对玉叶金花的石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位进行了活性筛选，研究发现玉叶金花的乙酸乙酯、正丁醇、水部位均有一定的抗炎作用，而目前对玉叶金花乙酸乙酯部位化合物的研究较少，故本研究对乙酸乙酯部位中的4种咖啡酰奎宁酸类化合物进行抗压活性筛选，为玉叶金花的进一步开发研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

1）分析天平（梅特勒百万分之一，瑞士）；2）培养箱（Thermo，美国）；3）酶标仪（BioTek，德国）；4）倒置显微镜（OLYMPUS，日本）；5）超净台（ATRTECH，日本）；5）离心机（湘仪，湖南）。

1.2 材料

1）小鼠RAW264.7巨噬细胞由广西中医药大学杨世林团队提供；2）绿原酸（纯度＞96.6%）、异绿原酸A（纯度＞97.3%）、异绿原酸C（纯度＞94.1%）购自中国食品药品检定研究院；3）异绿原酸B（纯度＞98.6%）购自上海安谱实验科技股份有限公司；4）培养基、胎牛血清（gibco，美国）；5）LPS、MTT（SIGMA，美国）；6）ELISA试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）；7）24、96孔板（洁特，广州）。

2 方法

2.1 体外抗炎试验

2.1.1 RAW246.7细胞复苏、培养、传代、冻存 1）细胞复苏与培养：从-80 ℃冰箱中取出细胞冻存管，迅速置37 ℃的水浴锅中，尽量使冻存管中的冻存物在1 min内迅速溶解，避免时间过长导致细胞受损，因为细胞在-5 ℃～0 ℃时最容易受损。因此，此部分的实验操作尤为关键。然后，迅速打开冻存管将细胞悬液移入提前准备好的10% FBS（含10%胎牛血清的DMEM培养基，以下统一用10%FBS）培养基中，用移液枪吹打几下混匀，800 r·min-1离心5 min，弃去上清，加入2 mL的10% FBS培养基至细胞沉淀中，用移液枪轻轻吹打细胞30次左右，将细胞悬液转移到加有3 mL10% FBS培养基的无菌培养瓶中，置37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养。2）细胞传代：待细胞生长密度达到80%时，弃去培养液，用2 mL PBS清洗2～3遍，加入2 mL培养基，用细胞刮轻轻刮下细胞，800 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用2 mL含10%FBS培养基将细胞悬浮，轻轻吹打均匀，按照1传2接种到新的培养瓶中，然后每瓶再加入3 mL的10%FBS 培养放置培养箱种继续培养。3）细胞冻存：首先配制细胞冻存液，取1个15 mL的无菌离心管，按DMSO:FBS=1:9的比例进行配制，备用。其次，将装有异丙醇的冻存盒放到37 ℃水浴锅中。细胞的收集同前期，将配好的冻存液加入装有细胞的离心管中，轻轻吹打混匀，每个冻存管1 mL，使用封口膜将冻存管封口，在冻存管上标明细胞名称、细胞代数、冻存日期、冻存人姓名。将冻存管放入冻存盒中，置-80 ℃冰箱冻存，第2天将细胞转移到液氮罐中长期冻存。

2.1.2 炎症细胞模型建立 取对数生长期的RAW 264.7细胞，细胞的收集同前期。加入1 mL10% FBS培养基，将细胞重悬，采用计数板（“计上不计下，计左不计右”的原则）在显微镜下进行细胞计数，以每毫升2×105个的密度接种于 96 孔板中，每孔100 µL，置37℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。弃去旧培养基，正常对照组每孔加入100 µL的1% FBS培养基，LPS模型组加入终浓度为1 μg·mL-1的LPS诱导24 h[6]，每组设3个复孔，诱导完成后，收集细胞上清液，采用Griess试剂盒检测细胞上清中NO表达水平，以确定LPS诱导炎症模型是否构建成功。

2.1.3 MTT法测定细胞毒性 实验分为空白组和给药组。给药组为终浓度为20 µm、40 µm、60 µm、80 µm、100 µm的绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的稀释液。取对数生长期的RAW 264.7细胞，细胞的收集同前期，以2×105个/mL，的密度接种于 96 孔板中，每孔100 µL，置培养箱中培养12 h后，弃去旧培养基，空白组每孔加入100 µL 1%FBS培养基，给药组每孔加入100 µL相应的药物稀释液，每组设3个复孔，孵育24 h。24 h后，弃去旧培养基，每孔加入10 μL MTT 溶液5 mg·mL-1以及90 μL DMEM培养液，避光孵育4 h后，以3000 r·min-1离心10 min，弃去上清，每孔加100 μL DMSO，置摇床上轻轻摇晃15 min，采用酶标仪在490 nm 波长处测定其吸光度（A）值。计算细胞相对存活率。相对存活率=实验组/空白组×100%。

2.1.4 Griess试剂测定NO释放量 实验分为空白组、LPS模型组、给药组。取对数生长期的RAW 264.7细胞，以每毫升2×105个的密度接种于 96 孔板中，每孔100 µL，置培养箱中孵育12 h后，弃去旧培养基，空白组与LPS模型组每孔加入50 µL 1%FBS培养基，给药组每孔加入50 µL相应的药物稀释液（给药浓度设置同MTT项下），每组设3个复孔。孵育1 h后，空白组加入50 µL 1%FBS，LPS模型组与给药组每孔加入50 µL终浓度为1 μg·mL-1的LPS，诱导24 h后，分别吸取每孔细胞上清40 µL置新的96孔板中，每孔加入40 µL Griess试剂，避光孵育30 min，采用酶标仪测定540 nm处OD值。

2.1.5 ELISA测定IL-6和TNF-α的释放量 实验分为空白组、LPS模型组、给药组。给药组为终浓度为 20 µm、40 µm、60 µm、80 µm、100 µm 的异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的稀释液。取对数生长期的RAW 264.7细胞，以每毫升2×105个的密度接种于24孔板中，每孔500 µL，置培养箱中孵育12 h后，弃去旧培养基，空白组与LPS模型组每孔加入250 µL 1%FBS培养基，给药组每孔加入250 µL相应的药物稀释液，每组设3个复孔。孵育1 h后，空白组加入250 µL 1%FBS，LPS模型组与给药组每孔加入 250 µL 终浓度为 1 μg·mL-1的LPS，诱导24 h后，收集细胞上清，采用ELISA试剂盒测定IL-6和TNF-α的OD值。

2.2 统计学方法

运用GraphPad Prism 6.04软件对数据进行处理，数据以平均值±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析对样本进行检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞实验

3.1.1 炎症细胞模型的建立 Griess结果显示，与空白对照组比较，经1.0 μg·mL-1的LPS 诱导后，LPS模型组的NO表达水平显著升高（P＜0.05），表明炎症模型构建成功（见表1）。因此，以下实验均采用1.0 μg·mL-1LPS诱导RAW264.7细胞来构建炎症模型。

表1 LPS对RAW246.7细胞NO表达的影响（n = 3）

3.1.2 MTT测定细胞毒性 MTT结果显示，与空白组比较，4种有机酸类化合物在终浓度为20 μm、40 μm、60 μm、80 μm、100 μm 的给药条件下，对细胞的存活力均无影响（见图1），表明在药物在0 μm～100 μm浓度范围内对细胞无毒性作用，因此采用0 μm～100 μm浓度进行抗炎活性研究。

图1 4种有机酸对RAW264.7 细胞存活力的影响

3.1.3 Griess试剂测定NO的释放 Griess结果显示（见图2），与空白组比较，LPS模型组的NO的表达水平显著升高（P＜0.05），而4种有机酸化合物处理后均能显著降低NO的释放。其中，异绿原酸B对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的抑制作用较为明显，其在浓度为20 μm已表现出极显著的抑制作用（P＜0.0001），而绿原酸只有在高浓度下可以抑制NO的释放。因此，推测异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C这3种有机酸类是玉叶金花发挥抗炎作用的主要活性成分。3.1.4 ELISA测定IL-6和TNF-α的释放 采用ELISA法测定IL-6和TNF-α的释放量，结果如图3所示，给药浓度为20 μm时，异绿原酸A和异绿原酸C对抑制IL-6的释放效果不明显，差异无统计学意义，而在40 μm、60 μm时，以上3种有机酸均可以极显著地抑制IL-6的释放（P＜0.000 1）。此外，研究发现3种有机酸对TNF-α均没有抑制作用。

图2 4种有机酸对LPS诱导的 RAW264.7 细胞 NO表达的影响

图3 异绿原酸A、B、C对LPS诱导的 RAW264.7 细胞IL-6和TNF-α表达的影响

4 讨论

玉叶金花临床用于治疗感冒及各种炎症，主要功能与炎症相关。目前已报道的玉叶金花中具有抗炎活性的化合物有咖啡酰甲酯、musseandoside R、musseandoside Q、musseandoside G、musseandoside U、玉叶金花苷酸甲酯[7-8]。因此对玉叶金花的抗炎活性研究具有重要意义。

LPS是刺激巨噬细胞释放炎症介质的有效物质，可通过诱导巨噬细胞分化为梭形巨噬细胞分泌多种促炎性因子，如NO、IL-6，IL-1β，TNF-α等[9-10]。NO则是一种重要的炎症介质，在炎症早期可以起到保护机体的作用，由于过量的NO与超氧阴离子O2-反应生成过氧化亚硝酸盐促使炎症发生[11]。本研究发现绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C这4种有机酸类化合物对NO均具有一定的抑制作用，此外异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C也可明显抑制IL-6的释放，其中异绿原酸B对炎症因子NO及IL-6的抑制作用最显著。因此，本研究认为咖啡酰奎宁酸类化合物的体外抗炎活性与化合物的结构存在一定的关系。

综上所述，本研究认为各抗炎成分间通过协同作用达到玉叶金花抗炎的效果，其具体的抗炎作用机制有待进一步的研究。