王自豪，陈政谕，黄春花，曹树威，吴翠兰，杨启晟，向 雷，滕少花，吴柱月

（1.广西畜牧研究所，南宁 530001；2.广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001）

孔雀属于鸟纲鸡形目雉科孔雀属，具有观赏价值和研究价值，人工饲养的孔雀还有食用价值［1］。火鸡组织滴虫属于鞭毛虫纲单鞭毛科组织滴虫属的寄生原虫，主要寄生在孔雀、野鸡、火鸡、鸡、鹌鹑等禽类的肝脏和盲肠，引起禽类的组织滴虫病［2，3］。该病一年四季均可发生，春季及夏季更易发病。患病的禽类主要表现为精神萎靡，厌食，羽毛蓬乱无光泽，下痢、粪便恶臭呈暗绿色或淡黄色，盲肠肿胀、出血、充血，肝脏表面有黄白色或黄褐色坏死灶［4］。沙门氏菌属于肠杆菌科沙门菌属成员，革兰氏染色为阴性杆菌。沙门氏菌可引起多种动物和人的沙门氏菌病，该病一年四季均可发生，尤其在多雨潮湿、圈舍污秽、拥挤、通风不良时多发，常呈散发或地方性流行［5］。患沙门氏菌病的禽类主要表现为下痢，肝脏肿大，有灰黄色坏死灶，肠壁肿胀、充血等。孔雀的观赏价值、研究价值和食用价值走进人们的视野，孔雀的养殖数量也不断增加，随着而来的疾病也呈现上升趋势，给养殖户带来重大的经济损失。对送检的病死孔雀进行临床诊断和实验室诊断，确诊病例是由组织滴虫和沙门氏菌混合感染引起的。该研究可以指导临床用药，为该病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品与试验动物

1 例病死孔雀来源于广西某养殖场；6 周龄健康昆明鼠10 只，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器

麦康凯琼脂培养基、TSA 琼脂培养基，购自北京路桥生物科技有限公司；PCR 仪，购自天根生化科技（北京）有限公司；通用型柱式基因组DNA 提取试剂盒、2×TaqMasterMix 等，均购自北京康为世纪生物技术有限公司等。

1.3 临床观察

通过问诊了解孔雀的发病情况，剖检病变观察获取更多信息。

1.4 镜检观察

刮取盲肠黏膜制作悬滴片和卢氏碘液染色，观察虫体。

1.5 细菌分离鉴定

无菌采取病死孔雀的肝脏接种于麦康凯琼脂平板和TSA 琼脂平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落的生长。

1.6 PCR 扩增

1.6.1 核糖体18S rDNA 序列的扩增和分析 取肝脏等病变组织，按照通用型柱式基因组DNA 提取试剂盒说明书提取DNA，置-20 ℃保存，备用。按照马骁骁等［2］方法合成18S rDNA 引物序列，引物序列上游引物F 为GAAAGCATCTATCAAGTGGAA，下游引物 R 为 GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA，扩增长度为580 bp。以上述DNA 为模板，F/R 为引物进行PCR 扩增、电泳、克隆测序。对测序结果运用MegA-lign 的Clustal W 方法和Mega7 邻接法进行同源性分析和进化树分析。

1.6.2 细菌16S rRNA 基因扩增 取纯培养物1 mL，按照通用型柱式基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，置-20 ℃保存。参考黄宇等［6］方法，引物27F为 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 和 1492R 为 GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增长度为1 500 bp。以上述 DNA 为模板，F/R 为引物进行 PCR 扩增、电泳、克隆测序，对测序结果用NCBI进行BLAST比对、分析。

1.7 分离株的生化鉴定

用接种针挑取纯培养物接种于葡萄糖、乳糖、甲基红、吲哚、VP 和尿素酶生化管中37 ℃培养24 h，观察结果，并根据《临床常见细菌、真菌鉴定手册》进行判定［7］。

1.8 分离株的药敏试验

将纯培养均匀涂在麦康凯琼脂平板上，采用KB 药敏纸片法对环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢曲松等27 种药物进行敏感性试验，经37 ℃培养24 h，观察并测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 临床观察结果

该孔雀养殖场主要是20～30 日龄的孔雀，发病率在10%左右，主要症状为羽毛蓬乱无光泽，精神萎靡，肛门有粪便。剖解发现肝脏表面形成黄白色相间的坏死点；盲肠肿大，盲肠黏膜及黏膜下层充血、出血和溃疡。养殖户曾使用过阿莫西林进行治疗，但不见效。

2.2 组织触片镜检观察结果

盲肠黏膜制作悬滴标本镜检发现有虫体做摇摆快速运动；卢氏碘液染色镜检发现有虫体（图1）。

图1 镜检结果（卢氏碘液染色，100×）

2.3 细菌分离鉴定结果

麦康凯平板和TSA 琼脂平板上均生长有细小、光滑菌落，从麦康凯平板上挑取单个菌落接种于TSA 培养基上37 ℃培养24 h 后也可见细小、光滑菌落，经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性杆菌。

2.4 PCR 扩增

2.4.1 核糖体18S rDNA 序列的扩增 核糖体18S rDNA 序列的PCR 扩增结果显示，扩增出了580 bp的目的片段，与预期大小相符合。将测序结果与6株火鸡组织滴虫参考株进行同源性比较，显示该试验株（Histomonas meleagridisgx）与参考株的同源性为97.4%～100.0%（图2）。进化树结果显示该试验株与参考株火鸡组织滴虫（登录号AJ920323）等处在同一分支上（图3）。表明试验扩增的病原为火鸡组织滴虫。

图2 火鸡组织滴虫的核糖体18S rDNA 序列同源性分析

图3 火鸡组织滴虫的核糖体18S rDNA 序列进化树

2.4.2 细菌16S rRNA 基因扩增 细菌16S rRNA 基因扩增结果显示，扩增出了1 500 bp 左右的目的条带，与预期的相符合。经过BLAST 比对分析（图4），该分离株与沙门氏菌参考株的同源性达到97.29%（登录号MT621367.1、CP050968.1、CP042438.1 等），说明该菌株为沙门氏菌。

图4 细菌鉴定结果

2.5 分离株的生化鉴定

生化试验结果显示，该分离株能发酵葡萄糖，不发酵乳糖，甲基红试验阳性，吲哚、VP 试验和尿素酶试验均为阴性，该生化试验结果表明菌株符合沙门氏菌的特性。

2.6 分离株的药敏试验

药敏结果显示该分离株对恩诺沙星高度敏感，对环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢曲松、氟苯尼考、诺氟沙星、阿莫西林、头孢西丁等8 种药物中敏，对四环素、庆大霉素、新霉素、头孢氨苄、链霉素、头孢拉定、卡那霉素、头孢他啶、氨苄西林、青霉素钠、丁胺卡那、红霉素、利福平、大观霉素、阿奇霉素、林可霉素、多西环素、复方新诺明等18 种药物不敏感。

3 小结与讨论

动物患病的情况较为复杂，有些疾病在临床症状上表现较相似，难以区分，需要借助分子生物学手段确诊，避免因误诊而导致不必要的经济损失。通过临床症状的观察、剖检病变、镜检观察、细菌分离鉴定及PCR 扩增等方法，确诊该孔雀病例为火鸡组织滴虫和沙门氏菌的混合感染。

组织滴虫病由Smith 于1895 年首次报道，中国于1965 年在江苏南京有报道，其后湖北、辽宁、吉林、河南等地均有报道［8-12］。早前，人们对寄生虫病的诊断只是采用临床观察法及虫卵的漂浮镜检等传统手段。随着科技的发展，研究者经常采用多种手段相结合进行诊断。核糖体18S rDNA 在进化过程中比较保守，在寄生虫分类和鉴定中常用［13］。王诗瑶等［14］以18S rDNA 为靶基因对研究重庆地区网状车轮虫展开研究。郝桂英等［15］以18S rDNA 部分序列为靶基因对枝睾阔盘吸虫凉山州分离株分析。本研究采用基于18S rDNA 基因序列核苷酸同源性分析显示，广西株火鸡组织滴虫与6 株火鸡组织滴虫参考株的核苷酸同源性为97.4%～100%，显示较高的同源性。为更进一步地了解广西株的分子特征，对18S rDNA 绘制核苷酸进化树，可见广西株与火鸡组织滴虫参考株出在同一分支，且与火鸡组织滴虫参考株（登录号AJ920323）的亲缘关系较近。由此可知，该广西株为火鸡组织滴虫。

孔雀病例中，由组织滴虫和其他病原引起的混合感染有报道，比如与大肠杆菌、异刺线虫、球虫、新城疫等病原［16-19］。研究中除发现火鸡组织滴虫外，还检测到了沙门氏菌。通过对沙门氏菌广西分离株的27 种药敏试验发现该菌株对四环素、新霉素、庆大霉素等18 种药敏不敏感，仅对1 种药物恩诺沙星高度敏感，对其余环丙沙星、氧氟沙星、头孢噻肟等8 种药物为中敏。由此可见该菌株对多数药物具有耐药性，出现了多重耐药，该结果与高延玲等［20］报道相一致。沙门氏菌的耐药性不仅体现在人源上，家禽、家畜、皮毛动物等的耐药性也越来越严重。张濛等［21］分析2015—2016 年河南人源沙门氏菌的耐药趋势，显示沙门氏菌对头孢西丁、头孢噻肟等4 种抗生素敏感率下降，对头孢他啶、氨苄西林、四环素的敏感率下降明显。夏宇飞等［22］检测湖南地区猪源和鸡源沙门氏菌耐药性，结果显示，沙门氏菌均对四环素、氨苄西林的耐药率在62%以上，对阿莫西林、氟苯尼考的耐药率在40%左右。李淑红等［23］检测湖南湘西北犊牛源沙门氏菌的耐药性，结果显示，沙门氏菌对诺氟沙星、红霉素、氧氟沙星等24 种药物产生耐药，耐药率为85.71%，对丁胺卡那和头孢他啶敏感，敏感率为7.14%。孙娜等［24］对狐源沙门氏菌的耐药性检测结果显示，沙门氏菌对氨基糖类药物、四环素、氨苄西林、诺氟沙星、环丙沙星、氯霉素耐药。耐药性出现，是由于在养殖的过程中大量使用抗生素，导致病原菌对药物耐药，甚至出现了多重耐药。耐药性可通过其他途径转移给其他病菌，危害着人类和动物的健康［20］。为了人类和动物的健康安全，应合理用药。

该病例发生于7 月，广西闷热、潮湿，为疾病的发生创造了条件，易引发混合感染、继发感染等。对于这两种病的防治，应该采取以下措施。第一，组织滴虫主要以异刺线虫为媒介通过消化道感染而引起动物发病，虫卵可携带火鸡组织滴虫，防治该病需要对全群饲喂左旋咪唑驱虫药，同时，选用高敏药物恩诺沙星进行全群用药。第二，对场地、饲舍进行彻底消毒，注意环境卫生，饲舍通风良好，饲养密度不要太高。第三，场地内外杜绝养殖鸡、鸭等禽类，减少疾病的交叉感染。总的来说，疾病的防治应当结合自身的情况充分开展工作，最大限度地降低发病率。