孟淑春，徐秀苹，刘立功，宋顺华，张 峰

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心/农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；2.中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093）

黄瓜（Cucumis sativusL.）是葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属黄瓜亚属中的一个种，起源于喜马拉雅山南麓的印度北部、锡金、尼泊尔和中国的云南地区。黄瓜通常以嫩瓜供食用，在长期的自然选择、遗传漂移和人工选育的多重作用下，形成了各具特色的黄瓜栽培类型和品种，并成为全世界主要蔬菜之一，以亚洲栽培最多。中国的收获面积150 万hm2，年总产量 2 555 万 t，居世界首位［1］。由于黄瓜适宜多种保护地栽培，加之保护地设施条件和栽培技术的不断改善和进步，延长了黄瓜的生长期，实现了黄瓜的周年生产和均衡供应，明显地提高了经济效益。人民生活水平的提高加大了对黄瓜品种类型多元化的需求。随着现代农业科技的发展，育种手段多样化，育种进程不断加快，黄瓜优新品种的数量也逐步增加。

品种纯度检测越来越受到育种家、种子经销商和种植农户的重视，商品种子纯度鉴定已经成为种子销售前确保种子质量的关键一环。传统的田间种植方法鉴定品种纯度，时间长、步骤多，时效性差，受土壤、温度等因素的影响，果实、茎叶等数量性状常常产生不同程度的偏差，受人为因素影响较大，检测的准确性不稳定，直接影响到优良品种的示范、推广和销售［2］。此外由于鉴定周期长，通常需要一个生长季，当年生产的种子往往要到次年才能销售，容易错失商机，且不利于新品种选育与示范推广的高效循环。分子标记技术日新月异的发展为提高品种纯度、品种真实性鉴定的准确性、时效性、可重复性提供了更为便捷的技术支撑，已经在一些主要农作物和主要蔬菜上取得良好效果，其中SSR 标记技术是最为简便、可靠的鉴定方法之一［3］，广泛地应用于水稻、玉米、棉花、油菜、茄子、大白菜等多种作物上。近年来在黄瓜重要基因定位［4-6］、种质资源多样性分析［7，8］、纯度鉴定［9-11］等方面得到广泛应用。

京研绿翡翠是北京市农林科学院蔬菜研究中心黄瓜开发课题组最新培育的保护地专用华南型黄瓜新品种。京研绿翡翠为强雌型黄瓜，瓜长17 cm 左右，瓜色绿、有光泽，瘤大较稀，生长势强，综合抗病性好，适宜春秋保护地种植。2020 年获得非主要农作物品种登记证书，为保证京研绿翡翠的商品种质量，现以京研绿翡翠父本、母本以及F1为材料，利用SSR 分子标记技术进行黄瓜纯度鉴定试验方法研究，筛选多态性丰富的SSR 引物，根据PCR 产物的带型差异，将特异性谱带作为SSR 分子标记，进行京研绿翡翠商品种的纯度鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

京研绿翡翠黄瓜及其父、母本，为北京市农林科学院蔬菜研究中心培育品种。

1.2 DNA 提取

将种子置于纸床发芽，种苗长到2.5 cm 左右，采用 CTAB 法提取种苗基因组 DNA［12］。

1.3 特异性条带筛选

以京研绿翡翠父本、母本及其商品种的种苗基因组DNA 为模板，采用63 对SSR 引物，引物来源参考文献［11］和［13］，由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用PCR 技术对重复序列进行扩增［10］，扩增结束后，采用2.5%高分辨率琼脂糖进行电泳。根据PCR 产物的带型差异，选择杂交种既具有父本带型又具有母本带型，即父母本互补型的引物，进一步检测个体。

2 结果与分析

2.1 特异性条带的筛选

应用63 对SSR 引物对黄瓜新品种京研绿翡翠父本、母本和F1的基因组DNA 进行PCR 扩增，通过对其SSR 带型进行筛选分析，每对引物扩增的位点为1～3 个，大小介于150～350 bp，大部分位点集中在200～300 bp。扩增产物电泳检测显示16 对引物在亲本和F1之间具有多态性，杂交种后代兼具父本和母本的带型特征，表现出共显性分离，具有互补性，可以用来鉴定杂交种的纯度。这16 对引物扩增得到的特异性片段构成了京研绿翡翠的SSR 指纹图谱。其中10 对引物扩增的多态性片段亮度相近，共显性片段清晰、片段长度差大于10 bp，易于辨识，分别 是 SSR03070、SSR05748、SSR02771、SSR06210、SSR03820、SSR11043、SSR22706、SSR07100、SSR 15955、SSR19918（表 1、图 1 至图 4）。另外 6 对引物SSR00262、SSR07131、SSR02309、SSR01012、SSR 31399、SSR03917，能够扩增出稳定条带，但是多态性片段长度差小于10 bp，电泳距离较短的时候不容易区分。

表1 多态性丰富的SSR 引物序列

图1 京研绿翡翠特异性标记SSR03070 和SSR05748

图2 京研绿翡翠特异性标记SSR02771、SSR06210、SSR03820

图3 京研绿翡翠特异性标记SSR11043、SSR22706、SSR07100

图4 京研绿翡翠特异性标记SSR15955 和SSR19918

2.2 SSR 纯度鉴定

随机选取400 粒京研绿翡翠黄瓜种子，从10 对产生特异性分子标记的SSR 引物中筛选出谱带最清晰的引物SSR05748 对其进行SSR 纯度鉴定（图5），结果表明，SSR 分子标记方法与田间鉴定方法的结果一致。

图5 特异性标记SSR05748 在京研绿翡翠父母本及其杂交F1中的扩增效果

3 小结与讨论

品种纯度是种子质量的重要指标，是种子质量评价和划分等级的重要依据［14］。品种纯度是种子的生命，品种纯度鉴定是种子生产销售工作中不可缺少的重要步骤，种子纯度如果出现问题，给农民造成的直接损失可达种子价值的100 倍以上。每年新采收的种子在出售之前，都需要进行纯度检测，以确保种子的遗传质量［15］。通过比对400 粒京研绿翡翠种子的田间种植鉴定和实验室SSR 分子标记检测，发现分子标记与田间种植在对种子进行纯度鉴定时的结果高度吻合，在统计上未显示明显的差异，采用SSR 分子标记技术替代田间种植纯度鉴定，不仅能够避免田间鉴定程序多、用时长、对环境条件要求高等缺点［2，9］，又大大提高了时效性，从而确保优良品种能够及时投放市场。

本研究中发现的16对SSR标记在京研绿翡翠父本、母本、F1的PCR扩增图谱中呈共显性，构成了京研绿翡翠亲本和F1的指纹图谱。核心引物SSR03070、SSR05748、SSR02771、SSR06210、SSR03820、SSR 11043、SSR22706、SSR07100、SSR15955、SSR19918扩增出的条带清晰、稳定，多态性片段大小差距大于10 bp，易于识别，SSR 分子标记纯度鉴定结果与田间种植鉴定结果吻合，为京研绿翡翠品种纯度、品种真实性鉴定提供了简便、快速、准确的鉴定方法，完全可以替代田间种植鉴定以避免资源浪费、节约土地和人力。京研绿翡翠指纹图谱不仅可以为该品种的审定、保护和亲本提纯提供技术支持，还可以用于该品种种子的快速纯度鉴定和品种真实性检测，并为其相关形态学性状和表型特征的基因定位、遗传图谱绘制分析提供基础信息，为同类型保护地专用华南型黄瓜品种纯度鉴定和真实性检测提供备选标记。

SSR 分布于黄瓜整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性［16］。采用SSR 分子标记技术鉴定黄瓜杂交种纯度时，揭示的是黄瓜基因组DNA 序列的多态性，因此SSR 引物选用的越多，鉴定结果的可靠性越高，但相应的成本也越高［2，17］。在实际制种生产中，黄瓜杂交种的混杂主要来源于制种过程中的母本自交及非父本花粉的杂交，所以黄瓜杂交种的纯度鉴定主要在于鉴别是否同时含有双亲血缘（条带），因此选用1 对共显性SSR 引物就可以达到鉴别杂种或者亲本的目的，从而达到节省人力物力、省时高效的目的。