崔红红 张幸媛 田宇豪 甘斌 尹燕 胡新喜 熊兴耀 秦玉芝

摘要

为了解湖南省马铃薯种薯质量和主要病毒病发生情况，2019年-2020年马铃薯秋作和冬作期间，对长沙、益阳、湘潭、澧临等马铃薯生产区的155个马铃薯样品，运用反转录 聚合酶链式反应（RTPCR）和双抗体夹心酶联免疫吸附检测（DASELISA） 技术，筛查6种主要马铃薯病毒，包括马铃薯X病毒 Potato virus X （PVX）、马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、马铃薯M病毒Potato virus M （PVM）、马铃薯S病毒Potato virus S （PVS）、馬铃薯A病毒Potato virus A （PVA）、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。检测结果表明：6种马铃薯病毒病在湖南均有不同程度的发生，单一和两种病毒复合感染植株占比最高，其次是3种病毒复合感染，存在极少数植株复合感染4～5种病毒病情况。在秋作马铃薯中，PVY检出率达到29.41%;PVS和PVA检出率均为27.94%;PVM、PVX、PLRV的检出率分别为20.59%、19.12%、17.65%。在冬作马铃薯中，PVX 检出率最高，达到31.03%;其次是PLRV，检出率为25.29%;PVS、PVM、PVA、PVY的检出率依次为19.54%、16.09%、10.34%、5.75%。综上所述，近年来湖南地区马铃薯病毒病发生有抬头之势，其中PVX和PVY最为严重，复合感染增加，受天气和种源影响，秋作马铃薯比冬作马铃薯情况严重。

  关键词

马铃薯;病毒病;调查鉴定;RTPCR;DASELISA

中图分类号：

S435.32

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020541

Investigation on occurrence of potato virus disease in Hunan province

CUI Honghong1，ZHANG Xingyuan1，TIAN Yuhao1，GAN Bin1，YIN Yan1，HU Xinxi1，XIONG Xingyao2，QIN Yuzhi1*

（1. College of Horticulture，Hunan Agricultural University， ERC for Horticultural Crop Germplasm

Creation and New Variety Breeding，Ministry of Education， Changsha410128， China; 2.Agricultural

Genomics Institute at Shenzhen， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen518120， China）

Abstract

To clear the quality of seed potato tubers and the occurrence of major virus diseases in Hunan province， 155 potato samples from Changsha， Yiyang， Xiangtan and Lilin potato production areas from 2019 to 2020 were screened for six major potato viruses， including Potato virus X （PVX）， Potato virus Y （PVY）， Potato virus M （PVM）， Potato virus S （PVS）， Potato virus A （PVA）， Potato leaf roll virus （PLRV）by  reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR） and double antibody sandwich enzymelinked immunosorbent assay （DASELISA）. The results showed that six potato virus occurred in different degrees in Hunan province. The proportion of single and two kinds of virus infection was the highest， followed by three kinds of virus infection， while there were very few plants infected with 4 5 kinds of virus diseases. In autumn potatoes， the detection rate of PVY reached 29.41%， those rates of PVS and PVA were 27.94%， while those of PVM， PVX and PLRV were 20.59%， 19.12% and 17.65%， respectively. In winter potatoes， the detection rate of PVX was the highest （31.03%）， followed by PLRV （25.29%）， while those of PVS， PVM， PVA and PVY were 19.54%， 16.09%， 10.34% and 5.75%， respectively. In conclusion， in recent years， the occurrence of potato virus diseases in Hunan province has been on the rise， especially PVX and PVY are the most serious， and the mixed infection is increasing. Affected by weather and provenance， the situation of virus infection in autumn potato is more serious than that in winter potato.

Key words

potato;viral disease;investigation;RTPCR;DASELISA

马铃薯Solanum tuberosum是一种分布广泛、适应性强、产量高且具有较高的营养价值和经济价值的作物。中国是世界上最大的马铃薯生产国之一，随着马铃薯种植面积的不断扩大，马铃薯受病毒病危害也越来越严重。病毒病导致的马铃薯植株退化，严重影响马铃薯的产量和质量，可使马铃薯减产20%～50%不等[1 3]。

已报道的马铃薯病毒病多达40种以上[4 6]，危害比较严重的主要有马铃薯X病毒 Potato virus X （PVX）、马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、马铃薯M病毒Potato virus M （PVM）、马铃薯S病毒Potato virus S （PVS）、马铃薯A病毒Potato virus A （PVA）、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。其中，PVY是侵染马铃薯最严重的病毒，在中国各地区的检出率均较高。感染PVY的植株通常表现出重花叶或不同程度的坏死斑，危害严重时可导致马铃薯减产80%[7];PLRV引起马铃薯卷叶，对马铃薯的侵染仅次于PVY， 尤其是在内蒙古自治区[8 12];其他4种病毒（PVX、PVS、PVM、PVA）单独侵染马铃薯时，表现症状不明显或不表现症状，复合侵染时会因病毒的数量、种类、侵染的程度等不同而表现出不同程度的花葉、卷叶或坏死症状[13]。目前湖南地区马铃薯脱毒种薯应用比例偏低，冬作马铃薯仅30%左右，薯农在马铃薯秋作时则习惯自留种薯。本文通过对湖南马铃薯主产区进行病毒发生情况调查，以了解近年马铃薯病毒病发生情况和病毒种类，为湖南地区马铃薯病毒病害防治提供参考依据。

1材料与方法

1.1样品采集

分别于2019年11月马铃薯秋作和2020年4月马铃薯冬作成熟期，从长沙、益阳、湘潭、澧临等马铃薯生产地区进行病毒病田间调查。采集有花叶、斑驳、卷叶、坏死等病毒症状的样品，症状不明显的地块采取五点取样法随机取样，样品茎叶 80℃保存备用。秋作采集样品68个，冬作中采集样品87个，共155个样品。样品包括‘湘马铃薯1号’‘费乌瑞它’‘兴佳2号’‘华薯1号’‘华薯2号’‘金湘’‘紫玉’等共42个品种（系）。

1.2检测方法

1.2.1DASELISA法

对所采集的155个样品进行DASELISA法检测6种病毒：向预先包被马铃薯病毒捕获抗体的微孔中，依次加入标本、阴性和阳性对照、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色， TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的马铃薯病毒含量呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD值），判定阴阳性。DASELISA检测试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司，具体步骤参照使用说明书。

1.2.2RTPCR法

抽取部分样品提取植物总RNA，采用北京天根生化技术有限公司的总RNA提取试剂盒，以不含6种病毒的马铃薯为阴性对照，分别含6种病毒的马铃薯为阳性对照。将提取的RNA反转录成cDNA，反转录试剂盒购自擎科生物技术有限公司，具体步骤参照GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2说明书操作。以反转录合成的cDNA为模板利用金牌Mix（购自擎科生物技术有限公司）进行RTPCR扩增，反应条件为：预变性94℃ 3 min;变性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30个循环;延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。参考文献[14]中的引物并结合Primer premier 5软件设计引物，由擎科生物技术有限公司合成。引物见表1。

2结果与分析

2.1马铃薯感染病毒病表型分析

本次调查过程中采集到的具有典型症状的样品如图1所示，表现为轻花叶，叶片褪绿，叶片颜色深浅不一，发生形变（b）;叶片出现坏死斑点，颜色较暗（c）;叶片褪绿，出现斑点，叶边缘以主脉为中心向上卷曲（d）;叶面粗糙，没有光泽，叶片出现黄绿相间的斑点（e）;叶片出现坏死斑点，叶边缘以主脉为中心向上卷曲（f）;叶片中出现不规则的灼烧斑点，叶面粗糙，皱缩，叶片卷曲（g）;叶片颜色深浅不一，叶片中有不规则的灼烧斑点和青铜色枯斑，卷叶，植株下部叶片干枯（h）;叶片下垂，褪绿，出现青铜色枯斑，叶边缘以主脉为中心向上卷曲（i）。

经检测，a无所检测的6种病毒;b含PVX;c含PVY;d含PLRV;e含PVM;f含PLRV和PVY;g含PVA和PVM;h含PVS、PVX和PVY;i含PVS、PVA。

2.2DASELISA法检测分析

采用DASELISA法对155个样品（秋作中采集样品68个，冬作中采集样品87个），分别进行6种病毒检测。由表2可见，秋作马铃薯样品中，不同病毒复合感染情况高发。其中单一病毒感染样品占总样品数量的33.82%;其次是2种马铃薯病毒复合感染的样品占总样品数量的30.88%;感染3种和4种马铃薯病毒的样品较少，分别占总样品数量的7.35%和4.41%;本次调查发现有1.47%的样本为5种马铃薯病毒复合感染。

冬作马铃薯样品中，41.38%为单一病毒感染样品，3种马铃薯病毒复合感染的样品最少，占总样品数量的5.75%;2种马铃薯病毒复合感染的样品较多，占总样品数量的21.84%。

由表3可见，在秋作马铃薯中，所检测的6种主要马铃薯病毒均有涉及。感染PVY病毒的马铃薯样品最多，占总样品数量的29.41%; 感染PLRV病毒的马铃薯样品最少，占总样品数量的17.65%;感染PVA和PVS病毒的马铃薯样品较多，均占总样品数量的27.94%;感染PVX和PVM病毒的马铃薯样品较少，分别占总样品数量的19.12%和20.59%。

在冬作马铃薯中，所检测的6种主要马铃薯病毒均有涉及。感染PVX病毒的马铃薯样品最多，占总样品数量的31.03%;感染PVY病毒的马铃薯样品最少，占总样品数量的5.75%;感染PLRV病毒的马铃薯样品较多，占总样品数量的25.29%;感染PVM和PVS病毒的马铃薯样品较少，分别占总样品数量的16.09%和19.54%;感染PVA病毒的马铃薯样品占总样品数量的10.34%。

在所采集的155个样品中抽取8个样品进行RTPCR验证，结果见图2。

将8个样品DASELISA法和RTPCR法两种方法检测的结果整理见表4。由表4可知：除PVX之外，其他病毒两种方法检测的结果一致。

3讨论

马铃薯病毒病是我国马铃薯产业持续、健康、高效发展的主要障碍之一[15 19]。田间植株表型分析是病毒病发生调查最为便捷的方法，感染病毒的植株会随感染病毒种类、数量和程度等的不同而表现不同的症状（花叶、卷叶、皱缩、黄化、坏死），中等和重度单一病毒感染植株表现出典型的症状，田间调查易于辨识。调查发现，轻度感染和复合感染的植株，由于病毒种类和感染程度的变化很难根据田间植株症状进行准确判断。如植株表现重度花叶症状，通常是PVY病毒感染引起的，但PVA与其他病毒混合感染时也会表现出花叶的症状。ELISA和RTPCR技术的应用大大提高了马铃薯病毒病检测的准确性，其中，RTPCR技術由于其检测成本较低和灵敏度好应用日益广泛。

2013年吴兴泉等[20]和范国权等[21]分别对我国黑龙江、内蒙古、甘肃、云南等地马铃薯病毒病发生情况进行调查，结果均表明PVY和PVS为我国主要流行马铃薯病毒。2010年胡新喜等[22]对湖南省马铃薯主产区冬作马铃薯病毒种类及流行分析时发现，PVS检出率最高，其次是PVX和PVY。本次调查发现，湖南秋作马铃薯中，PVY检出率最高， 其次是PVS和PVA，复合感染高发;在湖南冬作马铃薯中，检出率最高的是PVX，其次是PLRV，该调查结果与10年前相比，PVS的检出率降低，PVX的检出率升高。湖南地区秋作马铃薯与冬作马铃薯相比较，前者病毒病发生种类多，程度更严重，原因有二，一是种薯质量的差异，秋作种薯大多是薯农自留种甚至购买商品薯做种，种薯带毒普遍，蚜虫传播病毒的毒源更多，冬作脱毒种薯使用率相对较高，种薯携带病毒较少，蚜虫传播病毒的毒源较少;二是气候的差异，2019年秋作遭遇连续40 d以上的高温干旱天气，干旱会加快病毒传播媒介对病毒的传播，高温抑制植物生长同时有利于蚜虫的活动，减弱马铃薯自身的抗病性，冬作生长季气候冷凉，病毒媒介昆虫活动减弱。

马铃薯病毒病的防治要从脱毒种薯的推广入手，生产中以预防为主，通过减少蚜虫等传毒媒介对病毒的传播来减少病毒对马铃薯的危害。就湖南省目前情况，必须重视种薯的质量，提高脱毒种薯的普及率，湖南马铃薯秋作播种时节由于北方种薯还未进入收获期，脱毒种薯引入受限，如果本地选择适宜区域，运用网棚进行控制规模的良种繁育生产，实现秋作马铃薯种薯自供应，可以有效改善湖南秋作脱毒种薯种源不足的现状。

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收稿日期：2020 10 15修訂日期：2020 11 25

基金项目：

国家重点研发计划（2017YFD0101905）;湖南省旱粮产业技术体系育种与良种繁殖岗位科学家项目

* 通信作者

Email：qyuz@163.com