彭雪峰 刘毅 赵飞 王瑞敏 张译心 贾跃进

摘要：目的 利用網络药理学和分子对接的方法分析血府逐瘀汤治疗失眠障碍的有效成分、靶点及通路，探讨其作用机制。方法 检索TCMSP数据库，获取方剂各药物有效成分及靶点;在GeneCards等数据库中检索疾病相关靶点，获得方剂与疾病的交集靶点，并使用String数据库及CytoscapeV3.7.2构建疾病-药物-成分-靶点网络和核心蛋白互作网络;在Metascape平台对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析;选取核心成分与核心靶点分子对接。结果 总共得到血府逐瘀汤有效成分107种，对应靶点188个，与失眠障碍交集靶点70个，核心成分13种，核心靶点11个;GO富集分析共得1182条结果，主要有细胞对激素刺激的反应、肾上腺素受体活性、突触前膜等;KEGG通路富集分析共得88条通路，主要有：神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、胆碱能突触等;分子对接结果表明绝大多数核心靶点与核心成分能形成稳定结合。结论 初步揭示血府逐瘀汤治疗失眠障碍的关键成分、靶点及关键通路，以供临床使用和进一步研究参考。

关键词：网络药理学;分子对接;失眠障碍;作用机制;血府逐瘀汤

中图分类号：R256.23   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）01-0041-10

Network Pharmacological Study on the Mechanism of Xuefu Zhuyu Decoctionin the Treatment of Insomnia

PENG Xue-feng1， LIU Yi1， ZHAO Fei1， WANG Rui-min1， ZHANG Yixin1， JIA Yue-jin1

（1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China;2. The Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China）

【Abstract】Objective： To analyze the effective components， targets and pathways of Xuefu Zhuyu Decoction in the treatment of insomnia disorders by means of network pharmacology and molecular docking， and to explore its mechanism of action. Methods： The TCMSP database was searched to obtain the effective ingredients and targets of the prescriptions and to find disease-related targets in databases such as GeneCards to obtain the intersection targets of the prescriptions and diseases and to construct disease-drug-components -Target network and core protein interaction network by using the String database and CytoscapeV3.7.2， to conduct GO and KEGG pathway enrichment analysis on the intersection target on the Metascape platform and to select the core component to dock with the core target molecule. Results： A total of 107 active ingredients of Xuefu Zhuyu Decoction were obtained， corresponding to 188 targets， 70 targets that intersect with insomnia， 13 core components， and 11 core targets. The GO enrichment analysis yielded a total of 1182 results， mainly including cell response to hormone stimulation， adrenergic receptor activity， presynaptic membrane， etc. The KEGG pathway enrichment analysis yielded a total of 88 pathways， including： neuroactive ligand-receptor interactions， dopaminergic synapses， cholinergic synapses， etc. The molecular docking results showed that most of the core targets and core components could form a stable combination. Conclusion： The study preliminarily reveals the key components， targets and key pathways of Xuefu Zhuyu Decoction in the treatment of insomnia， and provides reference for clinical use and further research.

【Key words】Network Pharmacology; Molecular Docking; Insomnia; Mechanism of Action; Xuefu Zhuyu Decoction

失眠障碍（insomnia disorder，ID）是最常见的睡眠障碍，全世界约有10%的人口受其影响[1]。国际睡眠障碍分类（ICSD-3）中，将其定义为：有足够的睡眠机会和条件下，仍存在持续的入睡困难，睡眠维持困难，早醒或睡眠质量差，并导致某种形式的日间功能障碍的睡眠障碍[2]。研究证实ID是一些精神及躯体疾病发展的危险因素，是人们身心健康的潜在威胁，然而目前在其治疗上仍缺乏较为理想的药物[3-4]。中医药具有整体性以及多靶点、多途径发挥作用的特点，因此挖掘中医药可为ID的药物治疗提供新思路。

血府逐瘀汤（XFZYT）是清代医家王清任所创治瘀血名方，方含：柴胡（CH）、赤芍（CS）、川牛膝（CNX）、川芎（CX）、当归（DG）、地黄（DH）、甘草（GC）、红花（HH）、桔梗（JG）、桃仁（TR）、枳壳（ZQ）十一味药物，具有行气活血的功效。临床研究认为其治疗ID有理想效果，现代药理学研究亦表明该方药物具有保护神经和脑血管、改善微循环、抗抑郁、增强记忆等作用与ID有较大相关性[5-15]。另外该方通过多成分、多靶点、多通路发挥作用，因此有复杂网络的特质，所以通过网络药理学研究可一定程度揭示其作用机制，为临床应用及进一步研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分与靶点搜集 在TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分别检索XFZYT中各药物有效成分，按照OB（oral bioavailability）≥30%，BBB（blood brain barrier）≥-0.3，DL（drug—likeness）≥0.18的限定标准进行筛选，获得其有效成分后匹配相应靶点，再将得到的靶点在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）中匹配基因名。

1.2 疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库中，检索“insomnia disorder”，得到疾病的相关靶点，并取药物有效成分靶点与疾病靶点交集，以Venn图表示。

1.3 疾病-药物-成分-靶点网络和蛋白互作关系（PPI）网络构建 使用CytoscapeV3.7.2，将ID、XFZYT、有效成分、相关靶点作为节点，其相互关系作为边，构建方剂-药物-成分-靶点网络及疾病-药物-成分-交集靶点网络;再将药物-疾病交集靶点运用String数据库（https：//string-db.org/）构建PPI网络，并在Cytoscape中通过筛选得出核心PPI网络。

1.4 GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析 在Metascape平台（https：//metascape.org/）中导入1.2中交集靶点并分别进行GO分子功能、细胞成分、生物过程和KEGG通路富集分析，然后利用在线作图平台ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）绘制富集气泡图。

1.5 核心成分和核心靶点分子对接 选取1.3疾病-药物-成分-靶点网络中节点度>2倍中位数的核心有效成分及核心PPI网络中的核心靶点分别在ZINC（http：//zinc.docking.org/）、PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库中找到其3D结构，预处理后使用Autodock vina分子对接，并在Pymol中将其构象可视化。

2 结果

2.1 XFZYT有效成分与靶点搜集结果 通过检索TCMSP数据库并限定OB、BBB、DL值，获得CH有效成分9种，对应靶点85个;CS有效成分9种，对应靶点130个;CNX有效成分2种，对应靶点62个;CX有效成分6种，对应靶点54个;DG有效成分2种，对应靶点46个;DH有效成分2种，对应靶点34个;GC有效成分69种，对应靶点1270个;HH有效成分12种，对应靶点174个;JG有效成分2种，对应靶点29个;TR有效成分5种，对应靶点82个;ZQ有效成分3种，对应靶点82个。将其合并、排除并去重，共计得到XFZYT有效成分107种，包括重复成分5种，对应靶点188个，具体信息见表1。

2.2 ID疾病靶点与药物-疾病交集靶点搜集结果 在GeneCards、OMIM及TTD数据库中检索ID，分别获得靶点2281、673、28个，合并去重后共得ID靶点2916个。将其与2.1中XFZYT的188个靶点取交集，如图1，可得交集靶点70个，该70个靶点分属95种成分。

2.3 疾病-藥物-成分-靶点网络和PPI网络构建结果 方剂-药物-成分-靶点和疾病-方剂-成分-交集靶点网络构建结果如图2、3所示，其中图2中有307节点，1371条边;图3中有167个节点，762条边。结合以上两个网络并利用Cytoscape的NetworkAnalyzer插件计算节点度，得出节点度较大（DC>二倍中位数）的核心有效成分13个，具体如表2中核心成分列所示。再将70个交集靶点导入String数据库，选定物种为智人，得出以靶点为节点，蛋白互作关系为边的PPI网络，如图4，其中节点数为70，边数为509，平均节点度为14.5，平均局部聚类系数为0.656;同时使用Cytoscape分析PPI网络，筛选节点度大于1.5倍中位数的靶点为核心靶点并构建网络，可得核心靶点为：ALB、AKT1、FOS、VEGFA、CREB1、CCND1、ESR1、CTNNB1、AR、FGF2、ACHE，如图5。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果 使用Metascape平台对交集靶点分别进行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析得到1182条结果，包括GO生物过程、分子功能和细胞成分各1005、121和56条结果;KEGG通路富集分析则得到88条结果。然后以P值<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5筛选其前20、20、13和17项结果，绘制富集气泡图，如图6、7。结果可见，主要生物过程包括：细胞对激素刺激的反应、行为、化学突触传递、循环系统中的血管过程、神经递质水平调节等;分子功能主要涉及：肾上腺素受体活性、激素结合、铵离子结合、单胺跨膜转运蛋白活性等;细胞成分则主要有：突触前膜、受体复合体、膜筏等;通路则包含：神经活性配体-受体相

互作用、内分泌抵抗、多巴胺能突触、雌激素信号通路、胆碱能突触等。再以通路、交集靶点作为节点，其相互关系为边构建网络，如图8，其中神经活性配体-受体相互作用通路基因占比、q值都明显高于其他通路，因此可以判断药物最可能藉由该通路发挥作用，其具体作用机制如图9。

2.5 核心成分与核心靶点分子对接结果 核心成分与核心靶点分子对接结果绝大多數都小于-5.0 kcal/mol，如表2所示，可见绝大部分的核心成分与核心靶点组合都可形成稳定结构。然后使用Pymol将与每个核心靶点对接最稳定的核心成分的对接构象可视化，如图10，其中灰色部分为靶点，绿色部分为成分分子，其余各色标记残基，并显示名称，黄色虚线为氢键，并标示距离。

3 讨论

祖国医学将ID称为“不寐”，认为其总病机为“营卫失合，阴阳不交”[16]，如《黄帝内经》所述：“卫气不得入于阴，长留于阳，则阳气满，……不得入与阴则阴气虚，故不目瞑[17]。”可见营卫的运行是不寐发病的决定性因素。而与营卫运行最为相关的是周身气血的运行，所谓“气血冲和，万病不生，一有怫郁，诸病生焉”[18]。因此气滞血瘀可导致营卫运行紊乱发为不寐，另外不寐往往病程较长，“久病多瘀”，故综合来看治疗不寐当行气活血，且以活血化瘀为主，因此认为XFZYT可对证治疗ID。

本研究通过疾病-药物-成分-靶点网络综合分析筛选所得的核心成分中：成分A是天然植物甾醇，动物实验证实其可通过激活雌激素或NMDA受体，增强胆碱能神经传递系统而介导认知改善作用，并可通过升高γ-氨基丁酸（GABA）、谷胱甘肽及降低多巴胺（DA）、乙酰胆碱酯酶（AChE）等神经递质的水平而发挥改善精神症状和脑功能的作用[19-20];成分B是植物甾醇的主要成分，在中枢神经系统（CNS）中可表现抗焦虑和镇静作用，在小鼠脑中可通过增加去甲肾上腺素（NE）及5-羟色胺（5-HT）而介导抗抑郁样活性[21-22];D成分是天然黄酮类，在体内体外均有有效的神经保护作用，试验证实其在CNS中表现抗焦虑和镇静作用，其药理活性取决于GABA能非苯二氮卓类药物的位点[23-24];以上3种成分皆是药物的共有成分，分属8种药物，因此可以看出XFZYT中各药物存在协同作用。此外GC3、GC4、GC5、GC9、GC11、GC23、GC38、GC49、GC53、GC58都是甘草中的黄酮类物质，多项研究报道该类物质存在抗抑郁及神经保护作用[25]。

根据PPI网络筛选出的核心靶点中：ALB编码人类血液中最丰富的物质——血清白蛋白，已证实其是哺乳动物血清中存在的神经保护因子，且有动物实验表明其有增加睡眠的作用[26-28];AKT1基因编码的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶对神经系统的正常发育和功能至关重要[29];FOS的表达则被认为和觉醒有关[30];VEGFA和脑源性神经营养因子可共同发挥抗抑郁和神经营养作用，还可能对GABA能神经元产生影响[31-32];CREB1编码磷酸化依赖性转录因子，可参与包括昼夜节律同步等多种细胞过程，并且与快速眼动（REM）睡眠在抑郁症中的作用有关[33-34];CTNNB1编码的连环蛋白β1可介导Wnt信号而发挥DA能神经元保护作用[35];FGF2编码的成纤维细胞生长因子2有抗抑郁作用[36];ESR1和AR编码雌激素和雄激素受体，而性激素可对睡眠过程产生重要影响，雌激素和孕酮调控女性一生荷尔蒙周期相关的睡眠方式变化，雄激素则可影响昼夜节律的时相[37-38];ACHE编码的AChE通过水解乙酰胆碱而终止信号传导，其抑制剂可治疗REM睡眠行为障碍[39]。

GO富集分析所获得的主要生物过程中：细胞对激素刺激的反应是主要的生物过程，因XFZYT的核心有效成分多数有激素样作用，核心靶点中ESR1、AR等都与激素有关，而睡眠的生物过程是多种激素作用的结果，如：食欲素、褪黑素、生长激素、皮质醇等[40];睡眠和很多行为可相互影响，而与之相关的认知行为疗法（CBT）是目前治疗ID安全有效的一种方法[41];神经递质水平调节和化学突触传递生物过程则是腺苷、GABA、5-HT、褪黑素等促睡眠因子及DA、NE、组胺等促觉醒因子均涉及的生物过程[42];循环系统则与睡眠不同阶段显著变化有关，其中人脑血液循环与睡眠-觉醒的关联尤为重要[43-44]。KEGG通路富集分析所得主要通路中：神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、胆碱能突触都与睡眠的神经化学机制相关;内分泌抵抗、雌激素信号通路则与睡眠的激素调节相关;二者在之前GO富集分析中已做叙述，此处省略。由分子对接结果可得，绝大部分核心成分可与核心靶点形成稳定结构，将其进一步进行数据分析，得出对接较好的核心成分为：GC38（shinpterocarpin）、GC53（4-甲氧基光甘草定）、D（黄芩素）、A（豆甾醇），对接较好的核心靶点有：ALB、AKT1、AR、ESR、ACHE，可将这些成分和靶点认为是关键成分和关键靶点。

综合以上，可得XFZYT治疗ID的关键成分为：shinpterocarpin、4-甲氧基光甘草定、黄芩素、豆甾醇，作用于ALB、AKT1、AR、ESR、ACHE等关键靶点，通过调节血清白蛋白、AKT1激酶、性激素以及AChE，并藉由神经活性配体-受体相互作用、多巴胺能突触、胆碱能突触、内分泌抵抗、雌激素信号通路等通路发挥作用。该结论可为进一步研究提供一定参考与思路。

参考文献：

[1]Marques DR，Gomes AA，Caetano G，et al.Insomnia Disorder and Brains Default-Mode Network[J].Curr Neurol Neurosci Rep.2018，18（8）：45.

[2]American Academy of Sleep Medicine.International classification of sleep disorders，3red.Darien[S]，IL：American Academy of Sleep Medicine，2014.

[3]Buysse DJ.Insomnia[J].JAMA.2013，309（7）：706-716.

[4]Misra AK，Sharma PK.Pharmacotherapy of Insomnia and Current Updates[J].J Assoc Physicians India.2017，65（4）：43-47.

[5]郝学敏.加味血府逐瘀汤治疗失眠的临床研究[J].世界睡眠醫学杂志，2019，6（7）：904-905.

[6]Yang F，Dong X，Yin X，et al Radix Bupleuri：A Review of Traditional Uses，Botany，Phytochemistry，Pharmacology，and Toxicology[J].Biomed Res Int.2017，2017：7597596.

[7]赵兴梅，徐光忠，李建利等.川牛膝和怀牛膝的现代药理研究概况[J].华西药学杂志，2004（3）：205-207.

[8]袁蓉，施伟丽，信琪琪等.川芎—赤芍药对研究进展[J].环球中医药，2019，12（5）：808-811.

[9]董培良，李慧，韩华.当归及其药对的研究进展[J].中医药信息，2019，36（2）：127-130.

[10]李乃谦.熟地黄活性成分药理作用的研究进展[J].中国处方药，2017，15（1）：14-15.

[11]袁琴琴，刘文营.红花生物活性成分及功能特性研究进展[J].食品工业科技，2020，41（3）：332-338+344.

[12]许筱凰，李婷，王一涛等.桃仁的研究进展[J].中草药，2015，46（17）：2649-2655.

[13]李婷，徐文珊，李西文等.中药桔梗的现代药理研究进展[J].中药药理与临床，2013，29（2）：205-208+23.

[14]龚斌，李琴，胡小红等.枳壳化学成分及药理作用研究进展[J].南方林业科学，2019，47（3）：40-45.

[15]姜懿纳，罗林明，陈乃宏.甘草与神经退行性疾病的相关研究[J].中药新药与临床药理，2016，27（3）：455-460.

[16]王永炎，鲁兆麟.中医内科学[M].北京：人民卫生出版社，2005：315.

[17]王洪图.内经·灵枢[M].北京：人民卫生出版社，2000：87-88.

[18]朱震亨.丹溪心法[M].北京：人民军医出版社，2007：53-54.

[19]Park SJ，Kim DH，Jung JM，et al.The ameliorating effects of stigmasterol on scopolamine-induced memory impairments in mice[J].Eur J Pharmacol.2012，676（1-3）：64-70.

[20]Haque MN，Moon IS.Stigmasterol upregulates immediate early genes and promotes neuronal cytoarchitecture in primary hippocampal neurons as revealed by transcriptome analysis[J].Phytomedicine.2018（46）：164-175.

[21]Aguirre-Hernández E，Rosas-Acevedo H，Soto-Hernández M，et al.Bioactivity-guided isolation of beta-sitosterol and some fatty acids as active compounds in the anxiolytic and sedative effects of Tilia americana var.Mexicana[J].Planta Med.2007，73（11）：1148-1155.

[22]Zhao D，Zheng L，Qi L，et al.Structural Features and Potent Antidepressant Effects of Total Sterols and β-sitosterol Extracted from Sargassum horneri[J].Mar Drugs.2016，14（7）：123.

[23]Sowndhararajan K，Deepa P，Kim M，et al.Baicalein as a potent neuroprotective agent：A review[J].Biomed Pharmacother.2017（95）：1021-1032.

[24]de Carvalho RS，Duarte FS，de Lima TC.Involvement of GABAergic non-benzodiazepine sites in the anxiolytic-like and sedative effects of the flavonoid baicalein in mice[J].Behav Brain Res.2011，221（1）：75-82.

[25]Fan ZZ，Zhao WH，Guo J，et al，Antidepressant Activities of Flavonoids From Glycyrrhiza Uralensis and Its Neurogenesis Protective Effect in Rats[J].Yao Xue Xue Bao.2012，47（12）：1612-1617.

[26]National Center for Biotechnology Information[DB＼OL].PubChem Database.ALB -albumin（human），NCBI Gene=213，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/gene/213（accessed on June 14，2020）.

[27]Obál F Jr，Kapás L，Krueger JM.Albumin enhances sleep in the young rat[J].Physiol Behav.1998，64（3）：261-266.

[28]Cain LD，Nie L，Hughes MG，et al.Serum albumin improves recovery from spinal cord injury[J].J Neurosci Res.2007，85（7）：1558-1567.

[29]National Center for Biotechnology Information[DB＼OL].PubChem Database.NCBI Gene，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/gene/207（accessed on June 14，2020）.

[30]Pompeiano M，Cirelli C，Arrighi P，et al.c-Fos expression during wakefulness and sleep[J].Neurophysiol Clin.1995，25（6）：329-341.

[31]Deyama S，Bang E，Kato T，et al.Neurotrophic and Antidepressant Actions of Brain-Derived Neurotrophic Factor Require Vascular Endothelial Growth Factor[J].Biol Psychiatry.2019，86（2）：143-152.

[32]Barber M，Andrews WD，Memi F，et al.Vascular-Derived Vegfa Promotes Cortical Interneuron Migration and Proximity to the Vasculature in the Developing Forebrain[J].Cereb Cortex.2018，28（7）：2577-2593.

[33]National Center for Biotechnology Information[DB＼OL].PubChem Database.NCBI Gene=1385，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1385（accessed on June 14，2020）.

[34]Modell S，Lauer CJ.Rapid eye movement（REM）sleep：an endophenotype for depression[J].Curr Psychiatry Rep.2007，9（6）：480-485.

[35]Marchetti B.Wnt/β-Catenin Signaling Pathway Governs a Full Program for Dopaminergic Neuron Survival，Neurorescue and Regeneration in the MPTP Mouse Model of Parkinsons Disease[J].Int J Mol Sci.2018，19（12）：3743.

[36]Gupta S，M-Redmond T，Meng F，et al.Fibroblast growth factor 2 regulates activity and gene expression of human post-mitotic excitatory neurons[J].J Neurochem.2018，145（3）：188-203.

[37]Terán-Pérez G，Arana-Lechuga Y，Esqueda-León E，et al.Velázquez Moctezuma J.Steroid hormones and sleep regulation[J].Mini Rev Med Chem.2012，12（11）：1040-1048.

[38]Wittert G.The relationship between sleep disorders and testosterone[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes.2014，21（3）：239-243.

[39]Jung Y，St Louis EK.Treatment of REM Sleep Behavior Disorder[J].Curr Treat Options Neurol.2016，18（11）：50.

[40]Steiger A.Neurochemical regulation of sleep[J].J Psychiatr Res.2007，41（7）：537-552.

[41]Haynes J，Talbert M，Fox S，et al.Cognitive Behavioral Therapy in the Treatment of Insomnia[J].South Med J.2018，111（2）：75-80.

[42]Scammell TE，Arrigoni E，Lipton JO.Neural Circuitry of Wakefulness and Sleep[J].Neuron.2017，93（4）：747-765.

[43]Jafari B.Sleep Architecture and Blood Pressure[J].Sleep Med Clin.2017，12（2）：161-166.

[44]Elvsshagen T，Mutsaerts HJ，Zak N，et al.Cerebral blood flow changes after a day of wake，sleep，and sleep deprivation[J].Neuroimage.2019（186）：497-509.

（收稿日期：2021-11-08）