戴丽娜，陈泳君，杨 颖

连云港市食品药品检验检测中心，连云港222006

桑白皮为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮，又名桑皮、桑根白皮，始记载于《神农本草经》，具有泻肺平喘及利水消肿的功效[1]，是临床常用的中药材之一。近年来，有研究表明，桑白皮提取物具有美白功效，且因其毒性很低，相比于化学美白剂具有更高的安全性，同时桑树在我国广泛栽种，具有丰富的应用资源，成本低廉，从而在化妆品美白领域得到越来越多的关注，具有广阔的研发前景[2，3]。对于桑白皮中的有效美白成分，需要建立合适的提取方法，以达到既能有效地提取最大含量的活性组分，又不危害人员的身体健康、不污染环境的目的。通过查阅桑白皮的研究文献[4，5]，主要通过水、甲醇和乙醇进行不同程度的萃取。甲醇属于《化妆品安全技术规范（2015 年版）》中的禁用物质，即不得添加使用，但其可能作为其它化妆品原料的杂质被带入，故该规范规定化妆品中甲醇含量不得超过2000 mg·kg-1。乙醇作为一种有机溶剂，它会溶解皮脂膜甚至细胞间脂质中的油脂，造成皮肤屏障功能被破坏，对于含有乙醇的护肤品，一向存在争议。综合上述情况，本研究选取水作为提取溶剂。研究发现，桑白皮化学成分主要为黄酮、苷以及其他类型化合物[6]。2020 年版《中国药典》未对桑白皮成分含量测定项作出规定。本研究建立同时测定桑白皮水提物中6个主要成分（桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C）含量的方法，以期为桑白皮水提物中的成分进行测定提供依据。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Thermo U3000 高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；BT125D 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-300DE 型超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：绿原酸（批号：110753-202018，纯度：96.1%，购自中国食品药品检定研究院）；单宁酸（批号：040106-202203，纯度：98.46%，上海鸿永生物科技有限公司）；桑皮苷A（批号：JOT-11177，纯度：99.22%）、桑根酮C（批号：JOT-11145，纯度：90.90%）、桑根酮D（批号：JOT-11146，纯度：94.62%）、桑酮G（批号：JOT-11265，纯度：99.11%，自成都普菲德生物技术有限公司）。

乙腈（色谱级，德国Merck 公司）；甲酸为色谱级；水为超纯水。

桑白皮药材（来源：江苏仟草堂药业有限公司，产地：安徽，批号：211001、211003、211206、220510、220602、220603），经连云港市食品药品检验检测中心马冬云主任中药师鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 分别取桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 对照品适量，精密称定，置于同一50 mL 量瓶中，加甲醇适量，经超声振荡（频率：50 kHz，功率：200 W）溶解后，用甲醇稀释成桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 的质量浓度依次为1618、1609、1252、1642、1593、1549 μg·mL-1的混合对照品储备溶液。精密吸取该储备溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取经干燥后粉碎的桑白皮粉末约2.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入超纯水约50 mL，回流提取2 h，过滤，滤渣继续提取2 h，合并滤液，浓缩至10 mL，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：A 相为乙腈，B 相为0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱（0～10.0 min，5.0%A→35.0%A；10.0～20.0 min，35.0%A →50.0%A；20.0～30.0 min，50.0%A；30.0～40.0 min，50.0%A →70.0%A；40.0～42.0 min，70.0%A→5.0%A；42.0～50.0 min，5.0%A）；检测波长：270 nm（用于单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C）、320 nm（用于桑皮苷A、绿原酸）；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

结果表明，理论板数按桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 计均大于8000，各待测成分峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5。色谱图见图1。

图1 对照品和样品的HPLC 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1、1、1、2mL，分别置于50、50、25、25、10、5、5 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2”项下的色谱条件进样测定，以各成分的质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。

表1 6 个成分回归方程、线性范围及相关系数（n=7）

2.3.2 检测限和定量限 将“2.1.1”项下的混合对照品溶液，用50%甲醇逐步稀释至低浓度，以信噪比（S/N）3 作为检测限（LOD），信噪比（S/N）10 作为定量限（LOQ），得出桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 的检测限分别为0.13、0.33、0.32、0.15、0.17、0.30 μg·mL-1，定量限分别为0.43、1.10、1.07、0.50、0.57、1.00 μg·mL-1。

2.3.3 进样精密度试验 取“2.1.1”项下制得的混合对照品溶液20 μL，按“2.2”项下的色谱条件重复进样6次，记录结果，计算得出桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 峰面积的RSD（n=6）分别为0.41%、0.55%、0.83%、0.44%、0.25%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批号（211001）的桑白皮样品，分别按“2.1.2”项下的方法配制6 份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件平行测定6次，记录色谱图，用标准曲线法计算得出样品中桑皮苷A、绿原酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 含量的RSD（n=6）分别为0.44%、0.70%、1.46%、1.39%、0.55%，结果表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取已知含量的桑白皮样品（批号：211001）约2.0 g，共9份，精密称定，分为3组，每组分别精密加入混合对照品储备溶液（桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C的质量浓度依次为1618、1609、1252、1642、1593、1549 μg·mL-1）0.8、1.6、2.4 mL，按“2.1.2”项下的方法制得供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，用标准曲线法计算回收率和RSD，结果上述6 个成分平均加样回收率及相对标准偏差（RSD）分别为99.18%（0.45%）、99.06%（0.33%）、98.96%（0.59%）、98.76%（0.36%）、98.99%（0.47%）、98.90%（0.49%）。

2.3.6 耐用性试验 选取3 种不同型号的色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Supelco Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样测定并记录结果。通过分析高效液相色谱图，桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 在3 种色谱柱上均能与其他组分得到满意的分离度，样品色谱图中指标成分的色谱峰与对照品中相应峰在200～400 nm 波长范围内的UV 吸收光谱一致，表明方法耐用性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号：211001）适量，在室温下放置0、2、4、8、12、24、48、72 h后，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果24 h内桑皮苷A、绿原酸、单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 峰面积的RSD 分别为0.39%、0.68%（n=6），24 h 之后6 个成分的峰面积均减小30%以上，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好，超过24 h 供试品溶液中6 个成分均有较大程度降解，提示应在24 h内进样，以保证测定结果的准确。

2.4 含量测定

取收集到的6 批桑白皮样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批样品平行制备3份，分别将混合对照品溶液和供试品溶液按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。按外标法计算含量，结果见表2。

表2 桑白皮水提物中6 个成分的含量测定结果（μg·g-1，n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验参考相关文献[7，8]，分别考察了甲醇、乙腈作为有机相，水、甲酸水溶液、磷酸盐水溶液作为水相时桑皮苷A 等6 个指标成分的色谱峰分离情况，发现当选用甲醇-水作为流动相时，6 个成分的色谱峰对称性差，理论塔板数低，且基线不平稳，影响检测结果。当有机相改为乙腈时，虽然各峰之间分离度达到要求，但仍有有不同程度的拖尾现象。比较甲醇-0.2%甲酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%磷酸氢二钾水溶液，各成分色谱峰峰型均有所改善，但乙腈作为有机相时色谱峰对称因子更小，而且为使各成分色谱峰分离度符合要求，选择洗脱能力强的乙腈更有优势。在乙腈-磷酸盐体系下，各成分色谱峰均有良好的峰型；但从环保的角度考虑，还是选用0.2%甲酸水作为水相。由于各指标成分极性有较大差异，故选择梯度洗脱方式，从而缩短分析时间，提高分离效果。

3.2 检测波长的选择

按照上述确定的流动相，将混合对照品溶液进样测定，采用二极管阵列检测器，在波长200～400 nm范围内对待测分析物进行全扫描，结果如图2 所示，桑皮苷A、绿原酸在波长216、325 nm 处有最大吸收，单宁酸在波长216、278 nm 处有最大吸收，桑根酮C、桑根酮D 在波长282、310 nm 处有最大吸收，桑酮G 在波长262、317 nm 处有最大吸收，综合考虑末端吸收、检测灵敏度和其他干扰因素，最终确定采用双波长检测法，在波长270 nm 处检测单宁酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C，在波长320 nm 处检测桑皮苷A、绿原酸。

图2 6 个成分的光谱图

4 小结

建立的HPLC 双波长法可同时测定桑白皮水提物中桑皮苷A 等6 个成分的含量，分析时间在40min内，方法准确度、进样精密度、重复性及耐用性均符合分析方法验证要求，为定量分析桑白皮水提物中的主要成分提供了可靠的依据。同时对桑白皮水提物进行了稳定性研究，表明桑白皮水提物在24 h 内稳定性良好，在超过24 h 供试品中6 个成分均有较大程度降解，为桑白皮水提物在化妆品领域的开发应用提供了一定参考。