张萦倩 赵光义 韩雨薇 张静怡 曹成琦 王 力 张昆林

创伤后应激障碍的组蛋白修饰机制

张萦倩 赵光义 韩雨薇 张静怡 曹成琦 王 力 张昆林

(中国科学院心理研究所心理健康重点实验室, 北京 100101) (中国科学院大学心理学系, 北京 100049)

创伤后应激障碍是一种具有复杂病因学的精神疾病, 多发生于个体受到重大创伤事件后。创伤后应激障碍的发生发展过程受到环境和遗传易感性的共同作用, 存在着较大的个体差异; 而表观遗传学作为一门研究多变环境因素调控基因表达的可遗传变化的学科, 近年来在创伤后应激障碍的研究中受到越来越多的重视。表观遗传机制之一——组蛋白修饰机制在创伤后应激障碍的发生中起着重要作用, 并且由于组蛋白修饰可以受到多种酶的调控, 其灵活的可逆化和精细调控为相应的药物研发提供了可能性和便利。因此, 深入探讨创伤后应激障碍的组蛋白修饰机制, 对于相关疾病的临床治疗及药物研发具有十分重要的意义。当前创伤后应激障碍的组蛋白修饰研究主要使用动物模型, 临床研究较少; 组蛋白的类型则主要关注组蛋白H3和H4乙酰化; 此外, 同以往的研究结果一致, 组蛋白修饰水平的变化主要发生在前额叶、海马体和杏仁核区域, 参与免疫系统、血清素系统和神经肽Y能系统等相关通路的调节。当前PTSD组蛋白修饰的研究结果间还存在较大的异质性, 未来的研究应采用更加一致和实用的分析和报道方法, 以最大限度地发挥研究的影响。

创伤后应激障碍, 组蛋白修饰, PTSD啮齿动物模型, 药物研发

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)发生在创伤事件暴露之后, 是一种具有复杂病因的综合征。在美国精神病协会编制的《精神障碍诊断与统计手册(第五版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th ed., DSM-5) (American Psychiatric Association, 2013)中, PTSD的症状表现包括闯入(如闯入性思维、噩梦等)、主动回避(回避创伤相关的思想和可以提示创伤的线索)、认知和情绪的负性改变(如持续的负性情绪状态、丧失兴趣等)和高唤起(如过度警觉、睡眠问题)。PTSD会降低患者的生活质量, 病患的自杀率高于普通人群, 同时还会给患者家庭和社会造成极大的负担(Schnurr et al., 2009; Wang et al., 2012)。世界卫生组织在24个国家中开展的调查显示, 一般民众的PTSD终身患病率为3.9%; 一生至少会经历一次创伤性事件的个体超过70% (Benjet et al., 2016), 而PTSD患病人群占其5.6% (Koenen et al., 2017); PTSD的发病率还存在性别差异, 女性的患病率约为男性的两倍(Yehuda et al., 2015)。

尽管大多数人都会经历创伤事件, 但只有少部分个体会最终罹患PTSD, 这表明PTSD的发生发展存在着较大的个体差异(Heinzelmann & Gill, 2013), 同时受到遗传和环境因素的影响(Afifi et al., 2010)。例如, 双生子和家系研究估计PTSD的遗传度(heritability)为0.3～0.4 (Afifi et al., 2010), 全基因组关联分析研究(genome-wide association studies, GWAS)基于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)估计的遗传度为0.1～0.2 (Nievergelt et al., 2018, Preprint)。另一方面, 环境因子在PTSD的发生发展过程中占据着不可忽视的地位。已有研究表明, 创伤类型、发生创伤的频率和强度(Breslau et al., 1998), 以及经历创伤的年龄阶段(Nemeroff et al., 2006; Widom, 1999)等环境变量在PTSD的发病机理中起到了决定性作用。此外, 基因−环境交互作用研究进一步为遗传和环境因素在PTSD发生发展中所起的共同作用提供了实证证据(Li et al., 2019; Uddin et al., 2013)。

总的说来, PTSD的发生发展在很大程度上受到环境因素与遗传易感性共同的影响, 研究环境与基因交互作用的表观遗传学因而引起了研究者的重视。表观遗传学是研究在不改变基因核苷酸序列的情况下, 调控基因表达的可遗传变化的一门遗传学分支学科。该类研究为阐明环境对机体产生的持久性影响与PTSD发病的关系提供了方向, 近年来已受到越来越多学者的关注。例如, 当前有许多研究报告了军人或大屠杀幸存人群中创伤后应激障碍患者与健康对照组的表观遗传调控的差异, 以研究大型灾难事件对PTSD发生发展的影响(Bam et al., 2016b; Conrad et al., 2018; Hammamieh et al., 2017; Logue et al., 2020; D. Mehta et al., 2019); 一些研究者则致力于探索PTSD的代际遗传效应(Moser et al., 2015; Schechter et al., 2017; Serpeloni et al., 2019); 还有一些研究者则专注于研究童年创伤史对PTSD表观遗传机制的影响(Marinova et al., 2017; D. Mehta et al., 2013; Parade et al., 2017)。

诱发创伤后应激障碍并影响其发展的创伤类型多种多样, 促使研究者将环境多样性纳入PTSD病因学研究的考量中, 表观遗传学研究的重要性也由此凸显。本研究想就表观遗传机制之一的组蛋白修饰与PTSD间的关联研究进行归纳整理, 以小窥大, 以期从中寻找PTSD表观遗传学研究的一些共性, 为今后的PTSD生物通路研究或相关的治疗应用探明道路。

1 组蛋白修饰

组蛋白修饰是受到广泛关注和研究的表观遗传机制之一。表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA调控三类。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程。DNA甲基化一般与基因沉默相关, 去甲基化常与基因激活或表达量增加相关。RNA调控是通过RNA干扰等机制, 实现对基因转录的调控。如微小RNA (microRNA, miRNA)可以阻遏靶标基因的翻译, 也可以导致mRNA降解, 在转录和翻译水平影响基因表达; 长非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)可以通过参与DNA甲基化、组蛋白修饰等方式进行基因转录调控和基因转录后调控(Ha & Kim, 2014)。组蛋白修饰则是通过添加一个或多个化学基团(如乙酰基、甲基、泛素、磷、核糖等)对组蛋白进行修饰, 组蛋白修饰可以引起染色质结构改变和基因转录活性变化, 进而实现对基因表达的调控。不同的组蛋白修饰类型对转录效果有着高变异性, 如组蛋白乙酰化打开染色质构象以促进转录; 组蛋白磷酸化通常是DNA损伤的标志; 甲基化的转录效果也会受到修饰的组蛋白影响(Fairlie & Sweet, 2012; Yun et al., 2011)。

在这些表观遗传机制中, 组蛋白修饰可能是最为复杂的一种。组蛋白是染色质结构中最主要的蛋白组成部分, 组蛋白多样性的修饰及其时间和空间上的组合与生物学功能的关系被称为“组蛋白密码”, 扩展了DNA序列自身包含的遗传信息, 构成了重要的表观遗传学标志(Strahl & Allis, 2000)。组蛋白起着广泛的翻译后修饰作用(Zhou et al., 2011), 主要包括了乙酰化与去乙酰化、甲基化与去甲基化、磷酸化和去磷酸化、泛素化和去泛素化等动态可逆的共价修饰过程：(1)组蛋白乙酰化与去乙酰化最常见的修饰底物是组蛋白H3和H4, 主要发生在赖氨酸残基上, 分别由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)来完成, 这两种酶类通过对核心组蛋白进行可逆修饰来调节核心组蛋白的乙酰化水平, 从而调控转录的起始与延伸。乙酰化是最早被发现并得到深入研究的组蛋白修饰, 一般来说, 组蛋白乙酰化促进转录, 而去乙酰化抑制转录(Brownell et al., 1996; Taunton et al., 1996)。(2)组蛋白甲基化与去甲基化最常见的修饰底物也是组蛋白H3和H4, 主要发生在赖氨酸与精氨酸两种残基上, 由组蛋白甲基化转移酶(histone methyltransferase, HMT)和组蛋白去甲基化酶(histone demethylase, HDM)催化完成(Biel et al., 2005)。赖氨酸甲基化修饰包括单甲基化、二甲基化和三甲基化, 精氨酸甲基化修饰则包括单甲基化、对称和非对称甲基化(Martin & Zhang, 2005)。组蛋白甲基化修饰是一种重要的基因调节方式, 赖氨酸与精氨酸双位点修饰以及不同甲基化个数修饰的特点增加了组蛋白甲基化的多样性, 使得其调节功能更为复杂精细。(3)组蛋白磷酸化主要发生在丝氨酸或苏氨酸, 分别由蛋白激酶(kinase)和蛋白磷酸酶(phosphatase)催化磷酸基团的偶联和去除。组蛋白磷酸化不仅是某些信号转导通路的重要中间步骤, 参与基因表达的调控, 而且常与其他类型的修饰互相作用, 共同参与细胞分裂、影响细胞周期(Oki et al., 2007)。(4)H2A和H2B是被泛素化修饰最多的组蛋白, 组蛋白泛素化修饰是通过泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin- conjugating enzyme, E2)和泛素连接酶(ubiquitin- protein ligase, E3)的级联反应将泛素分子偶联到组蛋白赖氨酸上(Pickart, 2001)。H2A、H2B泛素化通常与DNA损害反应有关。

近年来, 研究者发现组蛋白修饰与创伤后应激障碍的发病机制有关。PTSD的发生发展通常与创伤事件相关的非适应性恐惧记忆有关, 持续的恐惧记忆是PTSD发病的重要基础, 而组蛋白修饰则是恐惧记忆巩固和消退的重要中介。研究表明海马、杏仁核和前额皮质中的组蛋白乙酰化、磷酸化和甲基化等在一系列条件作用范式中对啮齿动物恐惧记忆的巩固与消退发挥着关键作用(Maddox, Watts, & Schafe, 2013; Mahan et al., 2012; Monsey et al., 2011; Vieira et al., 2014; Zovkic et al., 2013); 此外, 研究者在人类创伤后应激障碍患者的外周血单核细胞中发现了组蛋白不同赖氨酸位点的甲基化差异, 提示了组蛋白甲基化对PTSD的调节作用(Bam et al., 2016a)。近年来, 研究者们相继研究了不同脑区中组蛋白修饰在恐惧记忆的巩固、再巩固与消退学习过程中发挥的作用(见表1), 这些研究强调了组蛋白修饰在恐惧记忆形成和消退的不同阶段存在的组织特异性。

可以看出, 不同组织的多种组蛋白修饰类型对PTSD病因学的调控机理存在着多样性。尽管以往的研究结果存在着较高的异质性, 研究者已经发现了一些针对组蛋白修饰的靶点及相关药物能够缓解创伤后应激障碍症状, 这表明了研究组蛋白修饰在PTSD发生发展和临床治疗过程中起着重要的作用。受限于目前研究PTSD相关组蛋白修饰调控机制的文献还较少, 我们接下来对相关文献进行了较为完整的阐述, 包括与组蛋白修饰研究相关的技术手段和方法, 以及涉及各脑区组蛋白修饰调控PTSD的具体结果, 以期能将各类信息进行分别汇总, 梳理组蛋白修饰参与的PTSD病理生理学机制, 为后来的研究提供可行的实验方案和具有潜力的研究方向。

2 PTSD组蛋白修饰研究方法与技术

当前PTSD的组蛋白修饰研究在实验设计方面存在着较大的差异。从表1可以看出, 各研究在被试、创伤类型(啮齿动物中采用的PTSD模型)、提取组织、组蛋白修饰鉴定技术等方面的选取上不尽相同, 这也造成了当前的研究异质性较大、结果难以统一的现状。

2.1 组蛋白修饰的研究技术

传统的组蛋白修饰鉴定技术如酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫组化(immunocytochemistry)等免疫测定法和Edman 降解法(Edman degradation)因其所需样品量大、实验流程繁琐或精度不高等原因, 正在渐渐被淘汰。当前, 常用的组蛋白修饰的检测技术包括了以抗体技术为基础的蛋白质印迹(Western Bloting, 或称免疫印迹immunoblotting)技术和染色质免疫共沉淀技术(chromatin immune- precipitation, ChIP), 其中, 后者可以研究组蛋白的各类修饰与基因表达的关系, 该技术主要利用特异性抗体来分析组蛋白在特定基因组位点或全基因组上的富集, 常与定量PCR (quantitative PCR, qPCR)技术、DNA微阵列(DNA microarray, CHIP)技术或深度测序(deep sequencing, Seq)技术等相结合。然而基于抗体技术的鉴定方法存在着几点不足, 如特异性抗体的开发和验证困难且昂贵; 特异性抗体可能与相似的组蛋白修饰发生交叉反应; 表位闭塞, 即靶向特定组蛋白修饰的抗体被预期外的翻译后修饰阻挡。上述提到的鉴定技术在PTSD组蛋白修饰研究中得到了较多的应用; 值得注意的是, 尽管鲜少见于PTSD研究中, 近年来质谱(mass spectrometry, MS)分析因其无偏倚性和高分辨率等优势已被视为组蛋白修饰研究的重要工具而得到了广泛的应用。质谱技术不仅可以探索新的组蛋白修饰、对组蛋白修饰进行定量检测, 还能鉴定组蛋白变体以及组蛋白的组合式翻译后修饰等(Britton et al., 2011; Janssen et al., 2017; Karch et al., 2013; Kimura, 2013; 王维等, 2012; 甄艳, 施季森, 2012)。

表1 PTSD组蛋白修饰研究中的研究方法与技术

注: SD: Sprague-Dawley; PBMCs: peripheral blood mononuclear cells; SPS: single prolonged stress; IFS: inescapable foot shock; SEFL: stress‑enhanced fear learning; ChIP: chromatin immunoprecipitation; qPCR: quantitative PCR; ELISA: enzyme- linked immunosorbent assay

2.2 PTSD的组蛋白修饰研究方法

想在人类患者中研究创伤后应激障碍症状的神经生物学机制及其相关脑区的组蛋白水平的变化是难以实现的, 因此, 众多研究者主要通过PTSD动物模型来研究大脑中组蛋白修饰与PTSD的关系; 同时PTSD动物模型还能为研究者观察各类药物缓解PTSD症状的功效提供便利。鉴于啮齿类动物中大鼠和小鼠繁殖快、数量大、来源广泛, 且便于完成基因工程操作, 因此研究者多采用PTSD啮齿类动物模型来模拟创伤后应激障碍, 相关的症状可以由啮齿类动物的恐惧条件反射和各类压力源诱发。目前已经有许多成熟的PTSD啮齿类动物模型可供研究者使用(Blouin et al., 2016; Zovkic et al., 2013)。

当前的组蛋白修饰研究中主要用到的PTSD啮齿类动物模型包括了电击模型、社会应激模型和单刺激应激模型等(见表1)。电击模型基于巴甫洛夫恐惧条件反射原理, 一般采用电击(如足底电击和尾部电击)来诱发动物的恐惧反应, 是常用的研究创伤后应激障碍动物模型。如Maddox等人(2013)采用巴甫洛夫恐惧反射作用训练PTSD大鼠模型(Maddox, Watts, Doyere, & Schafe, 2013), 另一些研究者则采用足底电击的方式使动物产生恐惧记忆和应激行为(Sase et al., 2019; Siddiqui et al., 2017; Siddiqui et al., 2019)。社会应激模型主要采用压力源模拟心理而非生理的压力, 如天敌模型, 让应激动物直接面对饥饿的捕食动物或闻嗅带有捕食动物气味的物品等, 使动物对个体生存感到威胁而产生极大的恐惧(Wilson et al., 2014); 如社会应激挫败模型, 则可以使动物在面对具有攻击性的同类时遭遇挫败而表现出强烈恐惧。单一延长刺激(single prolonged stress, SPS)模型属于单刺激应激模型的一种, 是目前常用的PTSD动物模型, 该模型会使动物出现空间记忆或者注意力缺陷, 还能够较好地模拟PTSD样动物中下丘脑−垂体−肾上腺轴(The hypothalamic-pituitary- adrenal axis, HPA axis)参与的抑郁症状, 并伴随有与PTSD患者类似的行为学反应(Liberzon et al., 1997; Liberzon et al., 1999)。单一延长刺激模型在研究组蛋白修饰与PTSD的关系时被广泛应用, 其常与恐惧记忆形成与消退训练相结合, 以研究动物的行为学反应和生物分子水平的变化; 研究者也会对SPS动物进行药物注射或喂服, 观察药物治疗对动物组蛋白水平变化的影响以及对恐惧等症状的改善作用(Ahmed et al., 2020; Alzoubi et al., 2019; Alzoubi et al., 2018; Matsumoto et al., 2013; Takei et al., 2011)。

由于在人类研究中一般只能将外周血或唾液作为研究组织; 而组蛋白修饰作为一种更精细复杂的、具有组织特异性的基因表达微调方式, 在人类被试中研究其动态变化具有较大的滞后性和局限性, 因此, 目前只有少量研究在PTSD患病人群中探索了组蛋白修饰对PTSD发病的影响。例如, Bam等人检测了全基因组上PTSD患者外周血单核细胞的组蛋白甲基化和DNA甲基化(Bam et al., 2016a)。

3 PTSD组蛋白修饰研究进展

我们在PubMed、PsychINFO和PsychArticles数据库中对PTSD组蛋白修饰的相关文章进行了检索, 检索时间截至2020年10月1日, 最终选取了16篇文献进行较为详细的整理、阐述和讨论(见表2和表3)。近年来的研究表明, 组蛋白修饰的整体作用与PTSD的发病和相关药物治疗效果紧密相关; 特别地, 组蛋白修饰在PTSD发病机制中还重点参与了炎症信号通路、氧化应激信号通路、5-羟色胺能系统(对HPA轴调控起重要作用)和神经肽Y能系统以及NMDA受体(N-methyl-D- aspartic acid receptor, N-甲基-D-天冬氨酸受体)相关通路等。

3.1 PTSD组蛋白修饰的整体作用

组蛋白修饰的整体作用影响着PTSD的发生发展过程(见表3)。有研究者报告了采用捕食者暴露模型后, 富集条件下小鼠的焦虑性行为减少, 这一现象伴随着组蛋白H3和H4乙酰化水平升高、组蛋白去乙酰化酶相关基因表达水平下调以及5-羟色胺能系统和神经肽Y能系统的一系列相关信号分子水平的变化(Ragu Varman & Rajan, 2015); Siddiqui等(2019)则更为详细地阐述了在对大鼠进行了恐惧记忆巩固和消退训练后, 组蛋白去乙酰化酶的区域特异性表达引起的组蛋白H3和H4乙酰化水平的变化(Siddiqui et al., 2019), 他们发现在对大鼠进行恐惧记忆学习和消退训练的不同阶段, 大鼠的组蛋白H3K9和H4K5乙酰化水平、组蛋白去乙酰化酶1 (Histone Deacetylase 1, HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2(Histone Deacetylase 2, HDAC2)的表达量在杏仁核(基底核团(basal amygdala, BA)、外侧核团(lateral amygdala, LA)、中央外侧杏仁核(centrolateral amygdala, CeL)、中央内侧杏仁核(centromedial amygdala, CeM))和前额皮质(边缘下区(infralimbic prefrontal cortex, IL-PFC)、前边缘皮层(prelimbic prefrontal cortex, PL-PFC))各亚区中呈现出不同的变化。具体说来, 恐惧记忆巩固训练后, 在大鼠的杏仁核中, 组蛋白H3K9和H4K5乙酰化和HDAC1的表达水平在杏仁核各亚区呈上升趋势, HDAC2的表达水平呈下降趋势; 在大鼠的前额皮质中, 组蛋白H3K9和H4K5乙酰化水平在PL呈上升趋势, 相应的HDAC1的表达水平在PL呈下降趋势, HDAC2的表达水平在PL和IL呈现下降趋势。恐惧记忆消退训练后, 在大鼠的杏仁核中, 组蛋白H3K9和H4K5乙酰化水平在杏仁核各亚区(除CeM)呈上升趋势, 相应的HDAC1的表达水平呈上升趋势, HDAC2的表达水平(除CeM)呈下降趋势; 在大鼠的前额皮质中, 组蛋白H3K9和H4K5乙酰化水平在IL呈上升趋势, 相应的HDAC1表达水平在IL呈下降趋势, HDAC2的表达水平在PL呈现上升趋势。这些结果也再次证实了他们在2017年得出的实验结论(Siddiqui et al., 2017)。

表2 靶向基因的PTSD组蛋白修饰研究

注: TrkB: Tyrosine Kinase receptor B; BDNF: brain-derived neurotrophic factor; Cdk5: cyclin-dependent kinase 5; IFNG: Interferon Gamma; TBX-21: T-Box Transcription Factor 21; IL-12: Interleukin 12B; B2m: beta2-microglobulin; Fkbp5: FKBP Prolyl Isomerase 5; Th: Tyrosine Hydroxylase; Fos: Fos Proto-Oncogene, AP-1 Transcription Factor Subunit; Arc: Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein; Gadd45b: Growth Arrest And DNA Damage Inducible Beta. ↑表示上升; ↓表示下降。

表3 PTSD组蛋白研究的治疗进展

续表3

注: HDAC5: Histone Deacetylase 5; CBP: CSK-binding protein; GSH: glutathione; GSSG: glutathione disulfide; GPx: Glutathione peroxidase; TBARS: Thiobarbituric acid reactive substances; HDAC1: Histone Deacetylase 1; HDAC2: Histone Deacetylase 2; CREB: CAMP Responsive Element Binding Protein; NFκB: nuclear factor kappa-B; 5-HT: 5-hydroxytryptamine; SERT: Recombinant Serotonin Transporter; PP1: protein phosphatase 1; S10: serine 10; 5-HT1A: 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A; CaMKII: Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II; 5-HT2C: 5-Hydroxytryptamine Receptor 2C; NPY: Neuropeptide Y. ↑表示上升; ↓表示下降。

3.2 PTSD组蛋白修饰的靶向基因

一些候选基因启动子区域富集的组蛋白修饰在PTSD样动物的恐惧记忆巩固和消退过程中起重要作用。当前, 一些研究者主要将目光集中于基因和基因等(见表2)。

在参与恐惧记忆形成的基因中, 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因在突触可塑性和学习记忆中发挥着重要作用, 靶向基因的组蛋白修饰因而得到较为广泛的研究。Bredy等(2007)发现小鼠恐惧记忆的消退伴随着前额皮质中显著增加的基因IV外显启动子上的组蛋白H4乙酰化(Bredy et al., 2007)。Lubin等人(2008)则发现在恐惧记忆巩固阶段, 小鼠海马体BDNF转录水平上调, 伴随着基因IV外显启动子的组蛋白H3磷酸化和乙酰化水平的升高(Lubin et al., 2008)。Takei等人(2011)采用情境恐惧条件测试了SPS模型对大鼠恐惧记忆巩固的诱发能力, 并分别检测了SPS大鼠海马体中总体和四个外显子(I, II, IV, VI)的mRNA水平、蛋白水平和组蛋白乙酰化水平及其酪氨酸激酶受体 B (Tyrosine Kinase receptor B, TrkB)受体蛋白的表达情况, 结果发现, SPS大鼠的恐惧记忆巩固能力增强, 海马体中基因调控的总体mRNA水平、蛋白质水平和TrkB蛋白水平均上升, 并伴随着基因I和IV外显启动子上的组蛋白H3和H4乙酰化水平升高(Takei et al., 2011)。这表明,基因外显启动子(主要为I和IV)的组蛋白修饰能够调控BDNF及其受体TrkB的分子表达水平, 进而对恐惧记忆的巩固和消退过程产生影响。不同于以往研究报告的组蛋白类型(乙酰化和磷酸化)和横向设计思路, Zhao等人(2020)主要报告了组蛋白H3K9二甲基化在基因启动子上的富集对青少年时期遭受创伤的大鼠的长期影响。作者测量了暴露于足底电击(inescapable foot shock (IFS) procedure)的青少年期大鼠及其成年后的行为学反应, 以及海马体和前额皮质中的神经元形态变化、组蛋白H3K9二甲基化水平及其在基因启动子上的富集、BDNF mRNA及蛋白质水平变化, 结果发现, IFS诱导了青少年期大鼠的类PTSD行为, 其海马体和前额皮质中的神经元树突分支减少、长度缩短, 进一步测量则发现, IFS引起大鼠海马体和前额皮质中组蛋白H3K9二甲基化的整体水平上升, 同时在基因启动子上观察到了组蛋白H3K9二甲基化的富集, 进而导致表达水平降低; 这些变化均能持续到成年(Zhao et al., 2020)。尽管不同研究中关注的组织类型和组蛋白修饰类型均有差异, 但不可否认的是, 靶向基因启动子的组蛋白修饰在PTSD的发生发展过程中发挥着关键的作用。

细胞周期素依赖蛋白激酶5 (cyclin- dependent kinase 5, Cdk5)被多次证明是参与恐惧记忆巩固和压力相关行为的关键基因, 有研究发现在雄性小鼠的海马体、纹状体和前脑中的条件性缺失可以调控恐惧记忆和类抑郁表型(Hawasli et al., 2007; Su et al., 2013; Zhong et al., 2014)。另有证据表明, 雄性小鼠的重复应激伴有海马体中的激活、糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的磷酸化和组蛋白去乙酰化酶2 (histone deacetylase 2, HDAC2)表达量的增加;启动子的组蛋白乙酰化会激活的表达, 从而影响应激(Rei et al., 2015)。基因在对恐惧记忆的调节中扮演了如此重要的角色, 吸引着研究者进行靶向基因的组蛋白修饰研究。Sase等人(2019)通过靶向组蛋白乙酰化的方法系统地研究了基因对小鼠的恐惧记忆提取能力的调控作用, 实验结果表明, 在长时恐惧记忆提取阶段发生了性别特异性的行为表现和表观调控。具体来说, 研究者首先在恐惧条件反射实验组当中比较了雄性和雌性小鼠的行为表现及其相关的组蛋白修饰水平变化, 结果发现雄性小鼠的长时恐惧记忆提取能力更强, 这与雄性小鼠特有的海马CA1区启动子组蛋白H3赖氨酸9/14乙酰化(histone H3 lysine 9/14 acetylation, H3K9/14ac)的富集相关; 随后实验者将靶向表观遗传编辑应用于小鼠CA1区中启动子H3K9/14的乙酰化, 以观察靶向基因的乙酰化对小鼠恐惧记忆提取能力的影响, 结果发现, 表观遗传编辑使得基因启动子的乙酰化激活了的表达; 在接受恐惧条件反射训练的实验组中, 相较于未接受表观遗传编辑的雌性小鼠来说, 进行了表观遗传编辑的雌性小鼠的长时恐惧记忆提取能力显著下降(但这种现象不存在于雄性小鼠中, 这可能归因于介导了雌性海马区tau蛋白的过度磷酸化) (Sase et al., 2019)。由此可见, 尽管存在性别差异, 但靶向的组蛋白乙酰化对恐惧记忆的调控作用毋庸置疑, 未来需要更多研究以支持和验证现有结论, 并且在此基础上进一步探索靶向的组蛋白修饰如何参与PTSD调控通路。

可以看出, 当前的PTSD组蛋白修饰研究关注的候选基因远远少于以往PTSD的GWAS研究所报告的数量(Zhang et al., 2017), 即便是靶向特定基因的PTSD组蛋白修饰机制研究, 其对不同的候选基因的青睐度仍不尽相同(例如, 以往研究报告的基因启动子的组蛋白修饰种类包括了乙酰化、甲基化和磷酸化, 而报告的启动子的组蛋白修饰种类却比较单一)。的确, 我们不得不面对当前的实验技术及实际情况对研究的限制, 但研究更大范围内表观基因组上的组蛋白修饰对PTSD发病机制的影响也是未来需要我们投入更多目光的方向。

显然, 已经有研究者在朝着这个方向努力。一项表观基因组关联分析研究(epigenome-wide association study, EWAS)另报告了组蛋白甲基化的整体作用和其在炎症通路相关基因上的富集作为诊断PTSD人群症状的生物标志物的潜能(Bam et al., 2016a)。研究者不仅报告了患病和健康人群全表观基因组范围上组蛋白H3的K4, K9, K27和K36三甲基化存在显著差异, 还发现患病人群(Interferon Gamma)、(T-Box Transcription Factor 21)和(Interleukin 12B)基因启动子的显著激活与组蛋白H3K4三甲基化(histone H3K4 trimethylation, H3K4me3)和DNA甲基化相关。值得一提的是, 研究者还进一步探索了miRNA在调控这些促炎细胞因子的表达中扮演的角色, 他们发现在PTSD人群中许多miRNA的表达水平显著下调, 其中有部分miRNA靶向、或基因。该研究向我们展示了PTSD患病人群的促炎细胞因子表达水平的升高受到了组蛋白修饰、DNA甲基化和miRNA的共同调节作用, 为PTSD发生发展的表观遗传学研究提供了一种较好的思路(但需要注意的是, 该研究采用的患者样本量为PTSD患者17人, 对照组被试16人)。此外, Ramzan等人(2020)报告了一种组蛋白变体H2A.Z对恐惧记忆的调控作用。研究者发现海马体中组蛋白变体H2A.Z与(beta2-microglobulin)、(FKBP Prolyl Isomerase 5)和(Tyrosine Hydroxylase)基因的结合在雌性小鼠中显著高于雄性小鼠(这些基因与神经可塑性和记忆功能相关); 当对小鼠进行条件性敲除H2A.Z后, 实验者仅在雄性小鼠中观察到了恐惧记忆巩固能力的增强(Ramzan et al., 2020)。尽管当前的研究受限于各种因素而发展缓慢, 但我们不难从中看出在更大范围内探索多元化的组蛋白修饰对PTSD机制研究具有重要意义。

3.3 针对PTSD组蛋白修饰的相关药物治疗

组蛋白修饰对PTSD的调控较为灵活, 其可受多种酶类调节, 因而具有较好的临床应用价值, 现有研究相继报告了各类组蛋白修饰相关药物对PTSD样动物的治疗效果(见表3)。Matsumoto等人(2013)发现伏立诺他(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)只有在与消退训练相结合时, 才能够提高大鼠海马体中的NMDA受体NR2B mRNA水平、NR2B和CaMKII的相关蛋白质水平, 并且伴随着组蛋白H3和H4乙酰化水平的升高, 进而改善SPS大鼠的恐惧记忆消退障碍, 文章强调了药物与消退训练结合的必要性, 以及NMDA受体相关通路在利用伏立诺他治疗恐惧记忆时扮演的关键角色(Matsumoto et al., 2013); 尽管没有具体阐述组蛋白修饰水平的变化, 但Wilson等人(2014)发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid, VA)能够减轻捕食者暴露模型中大鼠的氧化应激反应和炎症反应, 纠正神经递质(儿茶酚胺和5-羟色胺)的异常分布, 促进大鼠恐惧记忆的消退(Wilson et al., 2014); Alzoubi等(2018)利用抗氧化剂己酮可可碱(Pentoxifylline, PTX)减轻了SPS大鼠的记忆损伤, 其可能的生理机制是在海马体中调节了氧化应激生物标志物水平、提高组蛋白H3乙酰化水平和BDNF转录水平, 从而改善记忆障碍(Alzoubi et al., 2018); Alzoubi等(2019)随后又在另一篇文章中报告了选择性磷酸二酯酶IV抑制剂依他唑酯(etazolate)可有效缓解SPS大鼠PTSD样症状, 促使模型诱导的海马体中氧化应激水平变化、降低的BDNF水平和组蛋白H3乙酰化水平正常化(Alzoubi et al., 2019); 维生素E也因其抗氧化特性而对认知功能具有保护作用, 研究者基于该种特性探讨了维生素E对SPS大鼠的记忆障碍及其相关生物机制的影响, 结果发现, 维生素E可以预防PTSD样大鼠的记忆损伤, 阻止PTSD样大鼠海马体中的氧化应激标志物水平、BDNF水平及组蛋白H3乙酰化水平的降低(Ahmed et al., 2020); 另一项研究则报告了一种天然组蛋白乙酰转移酶抑制剂garcinol可以减轻大鼠的恐惧记忆巩固和再巩固, 这一过程伴随着外侧杏仁核(lateral amygdala, LA)中组蛋白H3乙酰化水平的下降(Maddox, Watts, Doyere, & Schafe, 2013)。Zhao等人发现组蛋白甲基转移酶小分子抑制剂Unc0642能够缓解IFS诱导的青少年期大鼠及其成年后的一系列类PTSD行为, 调节神经元形态变化、组蛋白甲基化和基因的表达。可以看出, 现有研究间存在较大的异质性, 由于研究者使用的药物类型和观察的组织不同, 导致研究结果难以整合, 但这类药物研究的结果充分表明了药物调控组蛋白修饰水平的灵活性, 以及在未来治疗人类PTSD症状的巨大前景。

纵观近年来的PTSD组蛋白修饰研究, 我们发现, 不管是靶向特定基因抑或从表观基因组范围上进行探究, 不管是对PTSD样动物进行直接观察抑或药物治疗, 绝大多数研究通常仅关注一种而非多种组蛋白修饰类型对PTSD的调节作用。的确, “组蛋白密码”具有其复杂性, 不同的组蛋白修饰通常会协同作用, 以组合式的组蛋白修饰模式对基因表达和染色质变化产生影响, 这一点无疑增大了研究难度, 限制了当前我们对PTSD组蛋白修饰机制的认识; 组蛋白修饰同时又具有灵活性, 其在体内的变化是动态可逆的, 这同样增大了研究难度, 但其因此具有的药物治疗价值不容忽视。因此, 我们应当充分认识到组蛋白修饰机制的复杂性和重要性, 力争从多基因、多种组蛋白修饰类型协同作用的角度对PTSD组蛋白修饰机制进行更为全面和深入的探索。

3.4 PTSD组蛋白修饰的性别特异性

PTSD发病率存在着显著的性别差异, 女性患病率约为男性的两倍。但研究者为避免雌性生理周期对实验结果的可靠性产生影响[NIH对此提出了质疑和批评(Beery, 2018; Prendergast et al., 2014)], 目前大多数精神疾病(包括PTSD)相关的动物研究中所使用的都是雄性被试, 从表2和表3中可以发现这一现象。Kokras和Dalla (2014)还针对此现象发表了一篇综述, 阐述在以性别为导向的精神疾病预防、诊断和治疗的实验研究中纳入雄性和雌性动物的必要性(Kokras & Dalla, 2014)。尽管当前研究PTSD组蛋白修饰的性别差异的研究还较少, 但我们还是能从中对其涉及到的生物机制窥探一二。

上文中提到, Sase等人的研究表明对恐惧记忆的调控可以通过组蛋白乙酰化进行, 并且这些调控具有性别特异性; 组蛋白变体H2A.Z也被发现是一种性别特异性的表观遗传风险因子(Ramzan et al., 2020)。另外, 在Maddox等人(2018)的研究中, 虽然没有直接测量组蛋白修饰的水平, 但他们报告了PTSD女性被试和雌性小鼠中编码组蛋白去乙酰化酶4的(Histone Deacetylase 4)基因相关的生物分子水平变化。文章提到, PTSD女性患者全基因组上的甲基化水平受雌激素水平的调控, 其中基因的CpG位点甲基化水平高于正常被试, 研究者进一步检测了在恐惧条件反射实验中雌激素水平存在差异的小鼠杏仁核中Hdac4 mRNA水平, 结果发现小鼠杏仁核中Hdac4 mRNA水平在受到恐惧条件刺激后上升, 而雌激素的存在则可以保护小鼠, 防止其创伤记忆的形成, 并使表达水平降低。研究表明雌激素可能介导了的表达调控, 从而增加了女性患创伤后应激障碍的风险(Maddox et al., 2018)。

显然, 由于动物实验的局限性(包括性别选择、症状模拟的有效性等)以及在人类实验中进行组蛋白修饰机制研究的困难性, 当前对性别差异影响PTSD组蛋白修饰的生物调控过程的研究尚处于初步阶段。未来, 更多关注到PTSD发病存在的性别差异, 采用更大样本量的人类被试进行EWAS研究, 或对PTSD样动物进行表观遗传编辑以观察雌性和雄性动物的生物分子水平变化等研究, 都将对阐明PTSD组蛋白修饰中存在的性别差异起到良好的推动作用。

4 讨论与展望

可以看到, 当前的PTSD组蛋白修饰研究多采用较为成熟的PTSD啮齿动物模型, 而很少在人类被试中进行。这是因为PTSD组蛋白修饰在相关脑区中存在着动态精细的调节过程, 相对于人类被试只能提取被试的血液样本或进行尸体解剖的操作来说, 还能进行药物靶向治疗研究的动物模型体现出极大的优良性和不可或缺的重要地位。但需要注意的是, 在使用动物模型对人类PTSD的临床症状进行模拟时, 我们应谨慎对待各类研究中采用的动物模型所代表的意义。Chaouloff (2013)就曾在综述“”中提到, 当研究者把社会挫败模型当作抑郁症的动物模型来使用时, 其主要的症状如社会回避也被报道存在于患有恐慌症、社交恐惧症或者创伤后应激障碍患者当中; 并且有研究者在社会挫败模型中还观察到了惊跳反应增强这一属于PTSD的主要特征。Chaouloff建议研究者不把模型诱导的反应作为整体去对应某种疾病, 而是关注每个单独的反应本身, 将其作为疾病的某一维度去探索相关的神经生物学机制(Chaouloff, 2013)。

此外, 当研究者广泛地采用PTSD啮齿动物模型来进行模拟时, 大多关注与恐惧相关的PTSD核心症状而极少报告组蛋白修饰与PTSD其他症状簇的关联。例如, 越来越多的学者关注到了快感缺失在创伤性个体中扮演的重要角色, 他们发现快感缺失与创伤后应激障碍的风险增加有关, 并相继报告了与快感缺失症状相关的脑区(如腹侧和背侧纹状体、腹内侧前额叶皮层等)及其连通性(如钩束完整性, 伏隔核和右背外侧前额叶皮层的连通性等) (Fani et al., 2019; Frewen et al., 2012; Kashdan et al., 2006; N. D. Mehta et al., 2020; Olson et al., 2018; Risbrough et al., 2018)。但当前的研究多报告脑区功能连接与PTSD患者快感缺失症状的相关性, 鲜少有研究者探索快感缺失相关脑区中发生的组蛋白修饰水平在PTSD发生发展过程中的作用, 而在快感缺失作为其核心症状的抑郁症相关文章中该类研究则报告得较多(Dudek et al., 2020; Lepack et al., 2016; Pathak et al., 2017; Wilkinson et al., 2009), 这显然也是一个值得研究者关注和探索的方向。

此外, 当前有关PTSD组蛋白修饰研究的不足之处还在于动物模型研究多采用雄性, 探索性别差异的研究较少; 由于各类因素限制, 只有少量文章报告了表观遗传机制如组蛋白修饰和DNA甲基化、miRNA等相互作用、共同参与调节PTSD发生发展的研究(Bam et al., 2016a), 但笔者认为将目光着眼于此不会是件坏事, 单纯研究某一类表观遗传机制而忽略各类机制的共同作用对PTSD发病的影响只会导致我们的思维局限。对于具有复杂病因学的PTSD研究来说, 随着研究者们探索的逐渐深入, 也将敦促我们去思考和研究表观遗传机制的协同或拮抗作用对PTSD发病的贡献; 值得一提的还有, 近年来有学者发现除了经典的孟德尔遗传形式外, 代际遗传能够通过表观遗传机制对受创伤者的后代产生影响; 并且相较经典遗传学而言, 表观遗传学提供了一种更灵活的基因调控机制, 允许后代直接继承父母的某些适应性变化。Rodgers和Bale (2015)在综述中详细总结和探讨了父母(特别是父系)经受压力对亲代的影响及其相关的生殖细胞表观遗传标记的作用和特征(Rodgers & Bale, 2015)。当前探讨组蛋白修饰在PTSD代际遗传中作用的研究较少, 具有一定的研究潜力和价值。

总的说来, 研究者一般利用较为成熟的PTSD啮齿动物模型研究PTSD样动物体内的组蛋白修饰水平变化, 这些变化存在组织特异性, 研究的组织则主要集中在杏仁核、海马体和前额皮质脑区。不同的研究间存在一些共通点, 但是更多的是较大的异质性, 组蛋白修饰的多样性、灵活性和实验条件的局限性都使得想要研究PTSD相关组蛋白修饰及其相关的神经生物学机制变得困难, 而想要将PTSD动物模型的结果应用到人类临床研究中则有更长的路要走。因此, 利用PTSD啮齿动物模型研究其中的组蛋白修饰机制在未来一段时间内还将是主流手段。

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The mechanisms of histone modification in post-traumatic stress disorder

ZHANG Yingqian, ZHAO Guangyi, HAN Yuwei, ZHANG Jingyi, CAO Chengqi, WANG Li, ZHANG Kunlin

(CAS Key Laboratory of Mental Health, Institute of Psychology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)(Department of Psychology, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Post-traumatic stress disorder (PTSD) is a mental disorder with complex etiology, which mostly occurs after severe traumatic events. The genesis and development of PTSD involves complex interactions between environmental triggers and genetic susceptibility, resulting in great individual differences. As a discipline investigating the changes in gene expression regulated by environment factors, the role of epigenetics in PTSD is attracting more and more attention in recent years. Histone modification, as one of the epigenetic mechanisms, plays an important role in the biological pathways for PTSD. Since histone modification can be regulated by a variety of enzymes, its flexible reversibility and elaborate regulation provides the possibility and convenience for the corresponding drug development. Therefore, in-depth exploration of the histone modification for the clinical treatment and drug development of PTSD is of great significance. Current studies on histone modification in PTSD mainly use animal models, with few clinical studies, focusing on histone H3 and H4 acetylation. In addition, consistent with previous findings, the changes in histone modification mostly occurred in prefrontal cortex, hippocampus, and amygdala, involved in the regulation of related pathways including the immune system, serotonin system, and the neuropeptide Y system. Current findings about histone modification in PTSD showed great heterogeneity, future studies should adopt more consistent and practical methods of analysis and reporting, to maximize study impact.

post-traumatic stress disorder, histone modification, rodent model of PTSD, drug development

B845

2020-11-17

张昆林, E-mail: zhangkl@psych.ac.cn