陈雨然,刘 莉,李龙雪,洪 滔∗,刘隆霸,杨志龙,程 洪,刘志勇,3∗

(1.江西中医药大学实验动物科技中心,南昌 330004;2.江西医疗服务指导中心,南昌 330006;3.江西省中药药理学重点实验室,南昌 330004)

随着人类生活水平的提高和生活节奏的加快,由于长期的饮食不节,导致肥胖、高脂血症急剧增加,中医认为由于肥甘厚腻的饮食导致脾胃运化失调,以致摄入的水谷精微不能转化成我们身体需要的能量和营养,而是转化成痰湿,淤积在体内,若脾胃功能失常,饮食水谷不能正常的输布,则聚而成痰、成饮,留贮体内渐成肥胖[1-2]。 可见肥胖、高脂血症的发生与形成与脾胃关系密切,“脾主运化,输布水谷精微,胃主受纳,腐熟水谷”,脾胃消化、吸收、输布功能正常,则水液输布正常,异常则水湿不化,聚而生痰[3-4]。 而中药江香薷,干燥地上部分入药,既能调中温胃,又能健脾化湿,还能开宣肺气而利水消肿[5-7],有实验发现香薷挥发油能改善由于饮食不节,潮湿环境,强迫游泳方法建立的湿困脾胃证大鼠的胃肠气机,调节水液代谢和机体免疫,提高中焦脾胃健运发挥治疗作用[8],为探讨江香薷水提液是否对高血脂大鼠的胃肠生理生化、水液代谢和机体免疫有影响,故而本实验通过高脂饲料喂养大鼠形成高脂血症模型,然后用江香薷水提液灌胃,来探讨江香薷对高脂血症大鼠胃肠道生理生化及免疫的影响,为江香薷更好在中医药及中兽药领域的应用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验大鼠为SPF 级雌性SD 大鼠30 只,体重200~220 g,由江西中医药大学实验动物中心提供[SCXK(赣)2018-0001],大鼠饲养于江西中医药大学实验动科中心无特定病原体级屏障系统内[SYXK(赣)2017-0004],环境温度为(21±1)℃、相对湿度46%~56%,饮水自由采集。 项目实施通过了江西中医药大学实验动物伦理委员会的审查(JZLLSC2019-0157),并严格遵守实验动物的3R 原则给予实验大鼠人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

江香薷(批号:180823)购自江西江中中药饮片有限公司;江香薷水煎液,江西中医药大学附属医院药剂组代煎,批号:121223,规格:1 g(生药)/1 mL,具体制备方法:1000 g 江香薷饮片加水10 L 水,浸泡1 h,煎煮,水提2 次,合并两次滤液,浓缩至1 ∶1液,即为1 g(生药)/1 mL 药液,无菌密封4℃冰箱保存备用。

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清腺苷脱氨酶(ADA)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、总胆汁酸(TBA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、极低密度脂蛋白(LDL)、岩藻糖苷酶(AFU)、脂蛋白(a)(LP(a))试剂盒由上海科华试剂公司提供;血清胃动素(MTL)试剂盒、胃泌素(GAS)试剂盒、淀粉酶(AMS)试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒、水通道蛋白2(AQP2)试剂盒、Na+-K+-ATP 酶试剂盒由上海赫澎生物科技有限公司提供;2%蓝色葡聚糖2000(DB-2000)。

全自动生化仪(贝克曼AU480); 酶标仪(Thermo);显微镜(IX37 生物显微镜);电子天平(AUY120 岛津分析天平)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模与分组

30 只大鼠检疫室里适应性饲养7 d,Excel 辅助下的随机数字法将其分为空白对照组6 只和余下24 只为高脂模型制作组。 6 只空白组给予湖北万千佳兴基础饲料(蛋白含量为20%),给予模型制作组大鼠高脂饲料,采用湖北万千佳兴的基础饲料,含量为79%,在这个基础料的基础上加入10%高胆固醇的猪油油脂、10%胆固醇、1%胆盐形成高血脂的造模饲料,四周后眼眶静脉丛采血检测血脂水平,根据甘油三酯水平留下18 只作为高脂血症的大鼠模型,再随机分为高血脂模型对照组、江香薷水提液高剂量及其低剂量组,每组6 只。 江香薷水提液高剂量为1 g/kg,低剂量为0.2 g/kg,灌胃量为1 mL/100 g,每天一次,每周记录一次大鼠体重,并调整江香薷的给药量。

1.3.2 实验动物临床表现的观察

实验期间,各组采食、饮水、活动正常,但模型组毛发粗糙,江香薷低、高剂量组毛发洁白光亮。

1.3.3 血常规检测

实验结束,取血500 μL,5 分类动物血球计数仪检测血常规。

1.3.4 血清生化指标检测

实验结束,取血2 mL,贝克曼480 全自动生化分析仪检测肝肾功能,血糖血脂指标。

1.3.5 肠胃指标的测定

(1)胃排空及小肠推进度试验。 参考文献[8]方法进行。

实验前禁食不禁水16 h,然后按每只大鼠0.4 mL 给予2%蓝色DB-2000(葡聚糖2000)灌胃,30 min 后对胃和小肠进行取材。 将取下的小肠摊平于平整的板上,先量取幽门括约肌至色素最前端的距离,然后量取幽门括约肌至盲肠的距离,据此计算小肠推进率。 小肠推进率=小肠内色素推进的长度值/全小肠长度值×100%

(2)肠管含水量的测定

大鼠取血后处死,取大肠5 cm 左右,在生理盐水中轻轻晃动肠道以洗去肠管中的食物残渣以及残留血液,然后用滤纸请按擦干,再放置于一张洁净的滤纸上,连同滤纸进行称重并记录,称重后的肠管标本送入烘箱中,60℃下恒温烘干10 h,10 h 后取出再次连带滤纸一同称重并记录第二次的值,按如下公式计算即位肠管含的水量。 肠管含水量=(大肠湿质量-大肠干质量)/大肠湿质量×100%。

(3)血清胃动素、胃泌素、淀粉酶活性、AQP2 和能量代谢指标的检测

大鼠采用股动脉放血法采血,收集于生化采血管中,室温下斜面静置,然后以转速3000 r/min 的离心机内离心10 min,仔细分离上层血清,置-80℃冰箱保存,按照ELISA 试剂盒说明书操作测量血清胃动素和胃泌素和Na+-K+-ATP 酶、淀粉酶活性和水通道蛋白2(AQP2)测定。

1.3.6 免疫学和炎症因子的检查

血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、补体(C3、C4)的检测。

同上处理的血清,贝克曼全自动生化分析仪检测IgA、IgM、IgG、C3、C4 水平,按照ELISA 试剂盒说明书操作测量血清IL-6 和TNF-α 的水平。

1.3.7 胸腺及脾脏器系数的测定和主要脏器的病理学观察

实验结束,胸腺和脾脏器系数的获取,动物处死后将胸腺及脾及时取出,分离干净后用滤纸吸去血污,立即在电子天平上称取重量,记录数值并按如下计算公式计算脏器系数:脏器系数=脏器质量(克)/体重(克)×100%。 心、肝、肺、胃、肠道等主要脏器无明显大体改变,将解剖后的脏器固定福尔马林溶液中24 h 之后冲洗、脱水、石蜡包埋固定后制片,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察脏器是否存在显微变化。

1.4 统计学方法

数据以Excel 建表后,使用IBM SPSS 20 应用软件进行组间数据显著性检验,采用单因素ANOVA检验体重、血常规、血生化指标、ELISA 数据,数据统计结果以平均数±标准差(±s)表示,作图软件用GraphPad Prism 8.0.2 应用软件。

2 结果

2.1 造模分组血脂水平和灌服江香薷后血脂的变化

由表1 可见,造模4 周后给药前各组的TCH 水平明显高于正常对照组,灌胃江香薷后TG,TCH 和LDL 水平与模型组比较有所降低,且差异显著P<0.05,而对HDL 的影响不大。

表1 造模分组血脂水平和灌服江香薷后血脂的变化Table 1 Blood triglyceride content after model establishment and effects of MCM on reducing blood lipid in rats

2.2 江香薷对高脂血症大鼠体重的影响

各个试验组在给药期间均无死亡,各个试验组在喂养过程中,体重呈递增状态,但是江香薷给药组在给药4 周后体重与模型组比较开始呈下降状态,差异显著(P<0.05),见图1。

图1 各组实验大鼠实验期间体重变化Figure 1 Changes in body weight of experimental rats in each group during the experiment

2.3 血液常规检测结果

血常规检查发现与对照组相比模型组江香薷组大鼠的红细胞、白细胞、血小板、均无明显变化,见表2。

表2 灌胃江香薷后各组大鼠血常规的影响Table 2 Effects of blood routine of rats in each group after administering MCM

2.4 血清检生化指标测结果

2.5 肠含水量和推进度指标的变化

高脂饮食导致肠道的水液积聚,含水量增加,推进能力减慢,见图3。 给江香薷后大肠含水量下降,推进速度增加。

图3 各实验组大鼠在食用江香薷后肠道相关指标的影响Note. Compared with the normal control group, ∗P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 3 Effects of intestinal related indexes of rats in each experimental group after fed with MCM

2.6 血清胃肠动力学指标

高脂饮食导致肠道动力学指标改变,其中血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平下降,而血清胃动素水平(MTL)升高,灌服江香薷后血清胃泌素(GAS)、淀粉酶(AMS)水平升高而降低了胃动素水平,见图4。

图4 江香薷对高脂血症大鼠的血清胃肠动力学指标的影响Note. Compared with the control group, ∗P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 4 Effect of MCM on serum gastrointestinal kinetics in hyperlipidemia rats

2.7 肠道水通道蛋白和Na+-K+-ATP 酶含量检测结果

如图5 所示,与正常对照组比较,高脂模型组大鼠血清Na+-K+泵的活性减弱,水通道AQP2 含有量增加,差异达到统计学的显著性差别(P<0.05) ; 与高脂模型组比较,江香薷水提液给药组大鼠血清Na+-K+-ATP 泵活性有所增加,高剂量的江香薷组与正常对照组无差别;AQP2 水平低于模型组(P<0.05) 。

图2 各组实验大鼠喂食江香薷后血清生化指标的影响Note. Compared with the normal control group, ∗P<0.05. Compared with the high fat model group, #P<0.05.Figure 2 Effects of serum biochemical indexes of experimental rats in each group fed with MCM

图5 江香薷对各组大鼠血清Na+-K+-ATP 酶活性和AQP2 的影响Note. Compared with the control group, ∗P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 5 Effect of MCM on serum Na+-K+-ATPase activity and AQP2 of rats in each group

2.8 免疫学检测结果

江香薷对大鼠血清白介素IL-6、免疫球蛋白IGM、C3 补体的含有量影响,对疫球蛋白IGA、免疫球蛋白IGG、补体C4 无影响,与正常对照组比较,高脂模型组大鼠血清白介素IL-6 增加,免疫球蛋白IGM、C3 补体含量减少,与高脂模型组比较,江香薷给药组大鼠血清IL-6、IGM、C3 含有量减少,结果见图6。

图6 江香薷对各组大鼠血清免疫及炎症因子的影响Note. Compared with the control group, ∗P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 6 Effects of MCM on serum immune and inflammatory factors in each group of rats

2.9 脾肝病理组织观察结果

各组的脾肝光学显微镜下基本正常,如图7。

图7 各组脾和肝均未发生明显病理变化。Figure 7 No obvious pathological changes occurred in the spleen and liver in each group

2.10 江香薷对大鼠胸腺及脾系数的影响

如图8 所示江香薷对大鼠胸腺和脾系数有影响,与对照组相比模型组和给药组的胸腺和脾系数有所减小,但与模型组相比随着给药量的增加胸腺和脾系数增大,但差异不显著(P>0.05)。

图8 江香薷对各组大鼠的脾和胸腺指数的影响Figure 8 Effect of MCM on the spleen and thymus index of each group of rats

3 讨论

中药或药食两用中药中有不少具有降血脂作用[9-10],江香薷属于药食两用类中药[11],它具有温胃和中、健脾化湿、发汗利尿等药理作用,临床上常用于治疗急性肠胃炎[12]、脾胃湿困等。 本实验结果高脂饮食后大鼠血脂水平升高,江香薷水提液显著降低了胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平,体重明显低于模型组,显示江香薷水提液可以明显改善由于高脂饮食导致的症状。 高脂饮食导致大鼠胸腺和脾脏体比减少,灌胃不同剂量江香薷水提液后,大鼠胸腺和脾脏体比增加,显示江香薷可以提高脾和胸腺的脏器系数,提示江香薷有一定的增加免疫器官重量的能力。

小肠推动实验能很好的反应大鼠的肠胃动力功能,本实验结果表明高脂饮食后大鼠的肠胃动力功能减弱而江香薷能明显改善模型大鼠的肠胃动力功能,提高大鼠脾胃的运化功能。 胃动素(MTL)是消化道激素之一,可以刺激胃运动,促进胃排空,胃泌素(GAS)是一种胃肠黏膜细胞分泌的胃肠激素,有促进食道括约肌收缩以及抑制小肠对水盐的吸收作用,本实验结果表明MTL 和GAS 有的上升趋势,1,4-α-D-葡聚糖水解酶是淀粉酶的全称,胰腺与唾液腺都分泌,该酶可以催化淀粉及糖原的水解,因而成为反应脾胃功能的重要指标之一,江香薷水提液灌胃后淀粉酶的活性明显增强,提示江香薷水提液能明显改善模型大鼠肠胃功能。 Na+-K+-ATP 泵在机体水液代谢、物质转运、能量转换等生理过程中发挥着重要作用,且江香薷挥发油灌胃给药组大鼠的Na+-K+-ATP 酶活性增加,综合以上结果表明江香薷能明显改善高脂模型大鼠脾胃功能。

江香薷作为一种价格经济、自然来源广泛的常用中药,前期的工作发现香薷挥发油有很好的药理药效作用,能用于改善湿困脾胃中的胃肠道功能,但挥发油的提取目前得率为0.6%[6],利用挥发油成本较高,本研究结果显示江香薷水提液对高脂血症大鼠的脾胃功能同样具有很好的改善作用,由于水提液的制备和获取量大,对江香薷的临床保健功能开发和中兽医兽药的进一步开发应用提供了良好的技术支撑。