环形LED 阵列光源显微成像系统设计

2022-01-14马骁颜晓萌

科学技术创新 2021年35期

马骁颜晓萌

（广东交通职业技术学院，广东广州 510650）

1 概述

虽然有许多先进的显微成像设备被发明，例如电子显微镜、原子力显微镜、荧光显微镜等，传统的明场光学显微镜仍旧是生命科学、材料学等领域不可替代的基本工具之一[1-4]。明场光学显微镜由照明光源、成像透镜组，以及载物台等部分组成。其中照明一般采用柯勒照明方式[1-4]，照明光由卤素灯这类热光光源加热灯丝产生。热光光源虽然具有发光光谱宽、照明亮度高等优势，但也存在光能转化效率低，使用寿命短，需要散热等缺点。而且，热光光源灯丝要保证照明亮度，通常制成特定的弯曲形状增大发光面积，只有使用复杂的光路，才能实现均匀的照明。相比之下，发光二极管（LED，Light emitting diode，LED）具有更高的发光效率，单色性好等优点，而且LED 本身具有聚光镜结构，LED 芯片发出光线经过聚光镜，可形成发散角较小的光束，当与样品距离远大于样品的尺寸时，照射在样品上的光束可近似看作平行光，无需复杂的光路，也可以提供均匀且高亮的样品照明，因此，LED 正逐渐取代传统照明光源，在显微成像领域发挥着越来越重要的作用[5-9]。此外，单颗LED 体积较小，便于各种形式排布，实现各种入射角的调制照明，这是其他光源难以做到的。

本文根据显微镜成像系统特点，结合环形LED 阵列光源，给出了一套显微成像系统设计思路，并列举出了该装置的使用实例，例如、差分相位显微成像[10,11]、暗场成像[12]。

2 显微成像系统设计

由于环形LED 阵列光源显微成像系统，可以实现光场显微成像、差分相位显微成像、暗场显微成像，需要对样品进行轴向扫描拍摄。下面给出了一种实现轴向扫描自动化拍摄的显微成像系统设计方案，该系统将包括硬件设计和软件设计两部分。在软件的编程控制下，实现自动化的显微成像拍摄。

2.1 硬件设计

在显微成像系统中环形LED 阵列光源被放置在样品正下方，其所在平面垂直于光轴，光轴穿过环形LED 阵列光源中心，LED指向决定照明数值孔径，要求与当前显微物镜数值孔径一致，与不同数值孔径的物镜匹配可采用多种环LED 阵列光源，根据需要控制其点亮环与所使用的物镜照明数值孔径匹配。成像系统中，所使用的无限远显微系统由物镜和管镜构成，通过物镜的光线在物镜后不直接成像，而是形成平行光束，进入管镜，在管镜一倍焦距附成像，成像探测器感光面与管镜后焦面重合。

为了便于自动对焦、寻找感兴趣区域，以及轴向扫描完成三维测量，机械样品位移台由一个长程二维水平X-Y 位移装置和一个长程高精度Z 轴向位移台组成，样品托架被固定在位移台顶端，位于环形LED 阵列光源正上方。二维水平X-Y 位移装置的作用是在水平方向大范围调整样品位置，便于寻找感兴趣区域，而Z 轴向位移台带动样品托架，实现高精度光轴z 方向调节，实现自动对焦并获取样品不同层的显微图像。样品托架用于固定待测样品。

2.2 软件设计

软件部分由拍摄准备程序段和拍摄程序段两部分构成。准备程序包括光源初始化程序、位移台初始化程序和相机初始化程序，在选择成像模式时自动开启。图2 是拍摄程序设计流程图。

初始化程序段是为了计算机与检测硬件间的通信状态，一般相机初始化程序较复杂，因此一般先从检测相机的初始化，调试顺利执行后，再进行其他初始化操作。

3 环形LED 阵列光源显微成像实验

采用上述设计方案可以实现多种成像模式，且可以应用不用倍数物镜，这里分别采用100 倍物镜和20 倍物镜分别进行实验，验证设计方案的可行性。

3.1 差分相衬显微成像

实验中采用的环形LED 阵列光源如图3 所示。

该光源由60 颗参数完全相同的LED 灯珠等间隔排列在环形内面，外径176 mm，内径140 mm，整体厚度15 mm，发光功率24 W，外壳采用铝合金材质，便于散热。光源发光中心波长520 nm，带宽10 nm，该光源被放在下样品正下方，光源面与样品平面平行，光轴经过光源中心，入射角为～64°，计算得到照明数值孔径NA=0.9。刚好与尼康100 倍（平场消色差物镜，NA=1.25）显微物镜数值孔径匹配。

无限远显微成像光学系统使用一台标准透射式的明场显微镜（Nikon 80-i）机架来搭建。使用高速灰度CMOS 相机（Andor，Zyla 4.2P）对样品进行拍摄。

机械样品位移台中样品托架采用悬臂式结构如图2 所示，样品被固定在一端，为保证水平需要在另一端调整配重，保证z轴位移台受力平衡。样品托架选择重量轻、机械强度高的钛合金作为制作材料。高精度z 轴向位移台使用纳米级z 轴位移台（PIHeraPiezo Linear Stage，P-621.1CD），闭环总调节范围100 μm，精度0.4 nm。样品为未染色的硅藻固定装片。

设置拍摄位置，照明模式按照上半环LED 灯点亮，拍摄得到图像I1 如图4（a）所示，上半环LED 灯熄灭，下半环LED 灯点亮，拍摄图像得到图像I2如图4（b）所示，根据公式差分相衬显微图像Id=（I1-I2）/（I1+I2），计算出差分相衬显微图像如图4（c）所示，可以看到经过计算后的图像中硅藻结构更加清晰了。