邹伟 赖纯米* 樊海青 罗春梅

（1、昆明医科大学公共卫生学院，云南昆明 650500 2、中国医学科学院医学生物学研究所云南昆明 650000）

食品安全一直是人们所关注的重大公共卫生问题，关系着广大人民群众的身体健康、经济发展和社会和谐稳定。饵块是云南民间常制食物，食前可切为块、丝或片状，烹食方法多样，风味各异[1]。饵块一般由大米、玉米或糯米加工制成，在运输和储存过程中，受到温度、湿度、空气等因素的影响，很容易被霉菌侵染。在我国食物被黄曲霉毒素感染状况较为严重，食用霉变后的粮食可引起急性或慢性中毒，长期食用甚至能引起癌症[2]。适宜的含水量、温度和充足的氧气都会影响霉菌生长和霉菌毒素产生[3,4]。饵块是云南特产具有地方区域性[5]，在我国其他省份和国外对饵块生长的霉菌的研究较少，此外饵块储存环境多样，不同环境储存饵块污染程度有待研究。检测真菌的方法有很多，传统的方法是观察菌落生长情况和菌体结构并参照菌落标准图谱从而鉴定鉴定出霉菌的属、群、系或种。其次是分子生物学手段，提取分离菌株的DNA，扩增其ITS 区并在NCBI 网站中进行Blast 从而对菌株进行物种鉴定[6-8]。本文在常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱中储存饵块，多个时间点统计污染饵块真菌菌落总数，提取分离真菌的DNA，扩增ITS 区测序并在NCBI 中比对，对真菌的种类进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 试剂与培养基

YPD 培养基（溶解10 g 酵母膏，20 g 蛋白胨于900 mL 水中，高压115℃，15min 灭菌后加入100 mL 20%过滤除菌的葡萄糖），DNA 提取试Taq 酶（北京百泰克生物技术有限公司），测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 样品采集

从昆明市市呈贡区超市内随机采集均一一致的饵块样本3份，样品购买后装入无菌塑料包装袋中，4℃保存于冰箱中，当天进行切块培养。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的分离培养

超净工作台中将饵块等体积切割后（25 cm2），分别置于常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱中，48、72、96、120 h 分别计数菌落总数，120 h 后挑取菌体YPD 固体培养基中进行纯化，4℃保存备用。

1.3.2 DNA 提取、PCR 扩增

纯化后，接种菌体于YPD 液体培养基中进行增菌培养，离心取沉淀后，利用真菌基因组DNA 提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），按照标准操作程序提取总DNA，通用引物ITS1/ITS4 对 ITS 区进行扩增。 其中 ITS1 序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4 为TCCTCCGCTTATTGATATG C。PCR 反应体积50 μL，包括2×Tag PCR Master Mix 25 μL，ITS1/ITS4 引物各2 μL，DNA 模板2 μL，其余体积以ddH2O 补充。序列扩增依照95℃ 5 min、95℃ 30 s、55℃1 min、72℃30 s，35 个循环，72℃10 min，4℃保存进行，PCR 结束后进行核酸电泳检测，将合格样品送出测序。

1.4 真菌的ITS 分子鉴定

PCR 产物生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得菌株完整的ITS 序列后，在NCBI 官网中，用Blast 程序将拼接后的序列文件与NCBI 核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息。

2 结果与分析

2.1 常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱中储存饵块菌落总数测定

日常生活中，饵块主要储存于干燥环境、潮湿环境、4℃冰箱中。为检测饵块在不同环境中的储存情况，分别模拟了常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱三种不同环境。将分割均匀的25 cm2饵块分别放置于三个区域，以4℃无菌袋饵块为对照，统计菌落总数。与对照组0 CFU/25cm2相比，48 h 常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱菌落总数分别为0、1.33（P<0.05）和0 CFU/25 cm2（表1）；72 h 常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱菌落总数分别为3.47、6.33 和1.67 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1）；96 h 常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱菌落总数分别为4.67、7.33 和3.33 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1）。72 h 后常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱均被真菌污染，4℃冰箱处于低温环境，抑制真菌生长，污染程度最小。

表1 不同储存环境中饵块生长菌落总数报告（n=3, ±s），*表示差异有统计学意义

表1 不同储存环境中饵块生长菌落总数报告（n=3, ±s），*表示差异有统计学意义

储存环境 48 h(CFU/25cm�) 72 h(CFU/25cm�) 96 h(CFU/25cm�) 120 h(CFU/25cm�)4℃无菌袋 0 0 0 1.33±0.47常温干燥区 0 3.67±0.47 * 4.67±0.47* 4.67±0.47*常温潮湿区 1.33±0.47* 6.33±1.25* 7.33±0.94* 9.67±1.24*4℃冰箱 0 1.67±0.47 * 3.33±0.47* 3.33±0.47*

120 h 后，4℃无菌袋中储存饵块也被真菌污染，与4℃无菌袋中储存饵块1.33 CFU/25 cm2相比，常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱菌落总数分别为4.67、9.67 和3.33 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1、图1）。常温潮湿区储存饵块湿润度和柔软度最好，但最易被真菌污染。120h 后，4℃无菌袋中饵块也被真菌污染，推测其原因可能是样品采集时饵块表面已被微生物污染。

图1 4℃无菌袋、常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱储存120 h 后饵块污染真菌情况*表示差异有统计学意义，*号越多差异越大

2.2 饵块表面污染真菌分离与鉴定

120 h 后，挑取常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱中菌落划线接种于YPD 平板，共分离得到23 株真菌。提取DNA 扩增得到18S rDNA 的ITS 序列，大小约为500 bp（图2），对分离到的真菌进行鉴定，结果显示，23 株均分属于2 个属，酵母菌属Saccharomyces 和青霉菌属 Penicillium，4 个种，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、异常毕赤酵母Pichia anomala、粘红酵母Rhodotorula mucilaginosa、青霉菌Penicillium crustosum。其中青霉菌10 株，占43.5%（表2），粘红酵母8 株，占34.8%（表2），酿酒酵母4 株，占17.4%（表2），异常毕赤酵母1 株，占4.3%（表2）。表明，本研究中，青霉菌和粘红酵母是污染饵块的主要真菌。

图2 23 株真菌18S rDNA 的ITS 序列扩增结果注：M 为500 bp Marker，18S rDNA 的ITS 序列大小为500 bp 左右

2.3 不同储存环境饵块表面污染真菌比较

比较常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱饵块表面污染真菌差异发现，常温干燥区青霉菌污染最严重，占21.7%%（表2）。常温潮湿区粘红酵母最多，其次是酿酒酵母，分别占21.7%和17.4%（表2）。4℃冰箱粘红酵母最多，其次是青霉菌，分别占13%和8.7%（表2）。此外，在三种环境中均检测到青霉菌，而潮湿环境中检测到酵母菌。表明酵母菌生长需要充足水分，在干燥区域不宜生长，因此干燥区储存饵块不宜受酵母菌污染。

表2 不同储存环境中饵块污染真菌鉴定结果

3 讨论与展望

饵块，是云南省的一种特产食物，深受广大云南人民的喜爱，其烹饪方法以蒸、煮、炒、烤等常见。但是饵块不易保存，暴露于空气中非常容易发霉。霉菌在粮食中的活动不仅影响粮食的食用及加工工艺品质，产生有毒代谢产物严重影响粮食及其加工产品的食用安全性。本研究在常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱中对饵块进行储存，发现72 h 后常温干燥区、常温潮湿区和4℃冰箱饵块均被真菌污染，其中4℃冰箱处于低温环境，抑制真菌生长，污染程度最小。对分离到的23 株真菌进行鉴定，发现分属于2 个属，酵母菌属Saccharomyces 和青霉菌属Penicillium，4 个种，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、异常毕赤酵母Pichia anomala、粘红酵母Rhodotorula mucilaginosa、青霉菌Penicillium crustosum。青霉菌和粘红酵母是污染饵块的主要真菌，在三种环境中均检测到青霉菌，酵母菌在潮湿储存环境中生长，干燥环境容易受青霉菌污染。酿酒酵母是乙醇生产的最常用的发酵菌株，一般情况无毒[9]，异常毕赤酵母耐受力强，多运用于酒精发酵[10]。粘红酵母能氧化烷烃，为较好的产脂肪菌种，在食品、医药工业中得到广泛的应用[11]，青霉菌常见于腐烂的水果、蔬菜、肉食及衣履上，常造成食品污染。虽然本研究检测到了四种真菌，但实验有一定局限性，饵块营养物质丰富在适宜的温度、湿度条件下，适合真菌生长，真菌生长情况和储存环境密切相关。