任晓琴，杨静慧，通信作者，刘艳军，张景新，马昕，冯国华

油用牡丹组培快繁研究

任晓琴1，杨静慧1，通信作者，刘艳军1，张景新2，马昕2，冯国华3

（1. 天津农学院 园艺园林学院，天津 300392；2. 天津市蓟州林业局，天津 301900；3. 天津市公路局直属处，天津 300074）

为建立油用牡丹组培快繁体系，本研究以油用牡丹腋芽为外植体，采用不同浓度的消毒剂进行表面消毒，获得无菌苗；将无菌苗分别接种到含有不同激素的MS培养基上，进行侧芽的增殖培养；将获得的再生苗接种到含有不同浓度的生长素培养基上进行生根培养。结果显示：采用15%的安替福民，处理5 min，获得的消毒效果最好；在MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3培养基上油用牡丹再生芽增殖效果最好；在MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC培养基上再生苗生根效果最好。本试验结果可以为油用牡丹的组培研究奠定基础。

油用牡丹；组培；腋芽；MS培养基

牡丹属于芍药科芍药属，是我国特有的传统名贵木本花卉，具有较高的欣赏价值、药用价值和油用价值[1]。近年来，相关调研发现油用牡丹‘凤丹’可作为木本粮油植物资源进行开发利用，油用牡丹一般产油量是1.1×103kg/hm2，远高于芝麻、油茶等，并且油用牡丹籽油多项指标超过了橄榄油[2-3]。因此，油用牡丹受众人喜爱，但在繁殖方面存在一些弊端。油用牡丹虽然有性繁殖系数大，但实生苗变异大，不能较好的保存母本优良性状，若对牡丹进行无性繁殖，受植物材料、外界环境影响因素较多[4]。繁殖成活率较低。因此，组织培养是牡丹繁殖方式的最有效手段之一。本研究旨在建立油用牡丹组培快繁体系，为今后油用牡丹的组培研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用油用牡丹‘凤丹’植株由蓟州区油用牡丹生产基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒处理试验

4月中旬，将田间的3年生油用牡丹植株移栽至花盆，在温室条件下培养30 d，待植株新梢长到20 cm时，在超净工作台剪取带有叶柄的茎段为外植体。先用70%的酒精消毒处理，再将其放在含有不同浓度的安替福民消毒液中分别消毒3、5、8、10 min，用无菌水反复冲洗3次。将消毒处理好的外植体接种到MS培养基上，将接种好的三角瓶置于温度为25 ℃，光照强度2 000 lx，24 h连续光照下培养。7 d后对试验结果进行统计[5]。

1.2.2 油用牡丹侧芽增殖培养试验

待油用牡丹腋芽萌发后，重新转移到新的MS培养基上进行培养。再生苗长到3 cm时，将其转移到含有不同激素的培养基上进行增殖培养。试验采用三角瓶的容器为100 mL，每瓶中接种3个芽苗，每个处理重复10次。培养条件与上一步骤相同。30 d后对试验结果进行统计。

1.2.3 组培苗生根培养试验

为了获得良好的油用牡丹组培生根苗，试验采用不同生长素进行生根诱导，同时采用不同渗透压进行辅助试验[6]。当增殖后的油用牡丹组培苗长到3～5 cm时，从外植体上剪下，将其接种到生根培养基上，每30个为一个试验处理组合。培养条件为：温度24 ℃，24 h连续光照，光照强度为1 000 lx。30 d后对生根结果进行统计。

2 结果与分析

2.1 油用牡丹外植体表面消毒试验结果

7 d后，接种到MS培养基上的油用牡丹外植体出现不同变化，具体消毒情况见表1。

表1 油用牡丹外植体消毒处理结果

从表1可以看出，不同浓度安替福民及不同消毒时间对于油用牡丹外植体消毒效果的影响存在较大差异。首先，采用较低浓度消毒液时，外植体污染率较高。随着消毒时间的延长，污染率逐渐下降，但外植体的死亡率增加，说明低浓度消毒液进行表面消毒，并不能收到理想的结果。同时，从试验结果还可看出，油用牡丹外植体长时间浸泡在消毒液中，会造成外植体的玻璃化现象，从而增加了外植体的死亡率；当增加安替福民的浓度时，消毒效果明显增强。但当消毒液浓度超过20%时，会对外植体造成伤害，死亡率也达到44%，说明油用牡丹外植体对安替福民较为敏感。因此，采用相对较低浓度的消毒液，在较短时间内消毒效果明显提高。从表中1知，采用15%的安替福民、消毒5 min时，获得的消毒效果最好，除了个别外植体死亡外，其他都可以实现表面消毒。

2.2 油用牡丹侧芽增殖培养试验结果

经过表面消毒后，将油用牡丹外植体转接到MS培养基，MS培养基中加入30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂粉；pH值调节到5.8。待腋芽长到2～3 cm时，将其从外植体上切下，接种到增殖培养基上，经过30 d的培养，在不同培养基上外植体侧芽萌发及生长情况出现不同变化，具体试验结果见表2。

表2 油用牡丹侧芽增殖培养试验结果

注：培养基具体配方为：1. MS；2. MS＋1.0 mg/L BA；3. MS＋0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；4. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；5. MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；6. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋0.5 g/L AC；7. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3

从表2可以看出，不同激素与培养基添加剂对油用牡丹侧芽增殖培养产生不同的影响。首先，采用MS培养基时，侧芽基本不萌发，随着培养时间的延长，植株出现玻璃化现象。甚至褐变死亡；当只使用分裂素BA时，植株生长缓慢，侧芽少数萌发，但萌发出的芽基本为玻璃化，随着培养时间的延长逐渐萎缩死亡；当采用BA与IAA配合使用时，侧芽萌发率明显增加，增殖系数相应提高，但萌发出的侧芽生长势较弱，多数出现玻璃化。为消除玻璃化对油用牡丹再生芽生长的影响，试验选用2种添加剂进行玻璃化的防治，分别加入一定量的活性炭和硝酸银[5]。试验结果显示，加入硝酸银效果明显，然而活性炭对玻璃化影响不大。加入硝酸银后，不但可以抑制再生芽的玻璃化现象，同时也可增加侧芽的萌发效率和生长速度。因此，选择MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3为油用牡丹增殖培养的培养基配方较合适。

2.3 组培苗生根培养的试验结果

将生长健壮的油用牡丹再生苗转接到含有不同生长素的培养基上，培养基中加入30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂粉；pH值调节到5.8。经过一段时间的培养，在组培苗的基部出现再生根，不同培养基上再生根的数量和生长情况不同，具体试验结果见表3。

表3 不同激素对油用牡丹组培苗生根的诱导结果

注：培养基具体配方为：1. MS；2. 1/2 MS；3. 1/2 MS＋0.5 mg/L IAA；4. 1/2 MS＋0.1 mg/L NAA；5. MS＋ 0.1 mg/L NAA；6. MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC

从表3可以看出，不同激素对于油用牡丹组培苗生根影响有较大差异。首先，若不加生长素，采用MS或1/2 MS组培苗均不能生根，说明油用牡丹生根较困难；当采用IAA或NAA诱导生根时，组培苗出现生根现象。从生根数量和生长速度来看，NAA明显优于IAA，当再生根继续生长一段时间后，组培苗逐渐停止生长，并且出现玻璃化现象。为此，在培养基中加入一定浓度的活性 炭[5]，试验结果显示，再生根生长正常，并有侧根产生，因此，选择MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC作为油用牡丹组培苗的生根培养基较合适。

3 讨论

3.1 油用牡丹组培苗玻璃化现象原因分析

在本试验中，油用牡丹组培苗经常出现玻璃化现象。一般组培苗玻璃化的原因主要有：一是对激素的反应，由于激素会对一些植物外植体产生一定的毒害作用，造成玻璃化现象，这个可以更换其他激素加以解决；二是内源乙烯过多[7]。也有可能是衰老、气体交换不畅等，可以加入乙烯抑制剂防止，如DTT、Vc、PVP等。另外，组织内的微生物污染也可造成植物材料的玻璃化现象。本试验中，油用牡丹组培苗玻璃化可能由内生菌引起，如植物植料表面所带有的各种细菌、真菌等微生物或是不能清除的植物材料内部的微生物（包括侵入的细菌、真菌、内生菌、病毒、类菌原体等）。在试验中虽然加入抗生素加以抑制，但油用牡丹对抗生素比较敏感，不但不能缓解玻璃化，还会加重这一现象。为此，本试验采用硝酸银来抑制内生菌，从而达到缓解玻璃化的现象。且硝酸银对油用牡丹毒害性较小[8]，同时可以抑制内生菌生长，试验结果比较理想，但使用时浓度不宜过大，否则会加剧玻璃化。

3.2 油用牡丹外植体选择方法

本试验选择油用牡丹新梢作为外植体，其原因有以下几点：第一，油用牡丹休眠芽内生菌较多，会出现严重的污染问题，虽然休眠芽可以消除消毒液对外植体的伤害，但内生菌采用表面消毒很难杀灭[9]。因此，采用新梢作为外植体，通过低浓度安替福民，较短时间的消毒，可以收到理想的消毒效果；其次，油用牡丹休眠芽在一般条件下很难萌发，因此在选择外植体的时候不建议选用休眠芽[10]。另外，油用牡丹新梢生长速度较快，获取外植体后，可以在很短时间内获得再生芽，加快进度，有利于试验顺利进行。

3.3 活性炭对油用牡丹生根的影响

油用牡丹再生苗生根困难，在使用生长素后，虽然可以获得一定数量的再生根，但多数不能正常生长，可能是再生苗伤口部位出现玻璃化，从而使这些组培苗的次生代谢物对组培苗再生根产生毒害作用，引起再生根玻璃化和死亡，不能实现组培苗顺利生根[11-12]。为此，本试验采用在培养基中加入一定量的活性炭，一方面吸附有毒物质，减少其对组培苗的毒害。另一方面，有助于组培苗的生根，而在一些试验中通常加入活性炭来诱导生根[13]。因此，在本试验加入活性炭，再生根出现侧根生长的现象对组培苗的移栽成活率有较大的促进作用。

4 结论

通过对油用牡丹进行组培快繁关键步骤试验，获得一般组培苗的培养方法概括如下：首先，选择生长健壮的油用牡丹新梢作为外植体，采用15%的安替福民作为消毒剂，处理5 min，可以获得的消毒效果良好的外植体；将消毒后的无菌苗在MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3的培养基上进行增殖培养，获得生长健壮的再生苗；将3～5 cm高的再生苗接种到MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC的培养基上，经过30 d可以获得生根良好的组培苗。本试验结果可为油用牡丹的组培研究提供参考。

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Study on tissue culture and rapid propagation of

Ren Xiaoqin1, YANG Jinghui1,Corresponding Author, Liu Yanjun1, Zhang Jingxin2, Ma Xin2, Feng Guohua3

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Jizhou Forestry Bureau, Tianjin 301900, China; 3. Tianjin Highway Bureau Direct Branch, Tianjin 300074, China）

In order to establish the rapid propagation system oftissue culture, this study usedaxillary buds as explants and used disinfectant of different concentrations for surface disinfection to obtain bacteria-free seedlings.The results showed that the best disinfection effect was obtained when 15% antihuman was used as disinfectant for 5min. In MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3medium, the regeneration bud proliferation effect ofwas the best.The best rooting effect was observed in MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC medium. The results of this experiment can lay a foundation for the study of tissue culture of.

; tissue culture; axillary bud; MS culture medium

1008-5394（2021）04-0019-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.005

S688.9

A

2019-09-24

天津市科学技术局项目（18JCTPJC68000）;天津市科技特派员项目（17ZXBFNC00310）

任晓琴（1995—）女，硕士在读，主要从事园艺植物栽培生理研究。E-mail：xiaoqin990714@163.com.

杨静慧（1961—）女，教授，博士，主要从事园艺植物栽培和生理生化研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。

责任编辑：杨霞