钱湃梓，彭桂原，郭 赛，林洁玲

鼻咽癌是中国的高发恶性肿瘤之一，尤其多发于南部地区如广东、广西、福建等省份。流行病学研究[1]显示，中国的鼻咽癌发病率达(30～50)/10万，病人数量约占世界总病人数的50%。放疗、化疗是当前鼻咽癌的共识性治疗方法，但常常难以避免地伴随治疗损伤，甚至致使部分病人不能耐受并终止治疗，影响病人的生活质量[2]。故此研究新型辅助抗肿瘤治疗药物以减少放化疗治疗的剂量、降低放化疗损伤，对于提升鼻咽癌病人的生存预期与生活质量显示出重要的意义。中药是中国传统医疗的知识瑰宝，其在现当代研究中显示出多靶点、多层次、多效应的药效特点，中药的抗肿瘤作用逐渐成为当前研究的新浪潮，近年来如木鳖子[3]、高丽参[4]、尖尾芋[5]的提取物等抗肿瘤作用也逐渐得到相关研究证实。因此探寻中药的抗肿瘤作用，有望改善鼻咽癌的传统治疗方式，提升治疗效果。皂角刺是传统医籍中具有行气化痰、散结消癥功效的药物，多项研究[6-8]表明皂角刺及其提取物对肝癌、肺癌、结肠癌均有一定的的抗肿瘤作用。本研究主要探索皂角刺提取液对鼻咽癌 CNE-2 细胞增殖与凋亡的影响，为鼻咽癌治疗探寻新型辅助抗肿瘤药物提供理论基础与依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、主要试剂与设备 人低分化鼻咽癌细胞株(CNE-2)，由中山大学附属肿瘤医院提供；皂角刺提取液，由康美药业股份有限公司提供并于广东省中医药科学院提取制备(产品批号20180716)；RPMI 1640培养液、FBS胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液、PBS磷酸盐缓冲液、MTT二苯基四氮唑溴盐溶液均购自Thermo Fisher Scientific公司；青链霉素混合液(100X)购自Solarbio公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司；超净工作台购自海尔公司；CO2恒温培养箱、移液器、酶标仪均购自Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞仪购自BD公司；旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸易公司；冻干机购自LABCONCO公司。

1.2 方法

1.2.1 制备皂角刺提取液 将皂角刺饮片置入烘箱 70 ℃干燥3 h后取100 g粉碎，使用3号筛过筛取得皂角刺粗药粉。将粗药粉干燥至恒重并冷却后精密称取600 g置于圆底烧瓶中，加入纯水600 mL回流提取2 h，将处理液通过0.22 μm微孔滤膜滤过，收集滤液并置于旋转蒸发仪中，调整压力至-400 mmHg、转速为100 r/min条件下加热蒸馏20 min，收集残留物。取残留物置于冻干机，调整温度为-50 ℃、压力至3 MPa条件下冻结升华，收集药粉作为皂角刺提取物。

1.2.2 细胞培养及药液制备 使用RPMI 1640培养液，并于其中加入10%的胎牛血清、1%的青链霉素混合液后充分混匀配置为完全培养液。将鼻咽癌 CNE-2 置于6 cm培养皿中，加入8 mL完全培养液，并置于95%饱和湿度、5% CO2、37 ℃条件下的培养箱中孵育，每24～48 h更换1次培养基，并于光镜下观察细胞生长状态。待贴壁细胞处于对数生长期，视野中呈80%左右融合后，加入胰蛋白酶液消化分离，待镜下观察细胞体回缩变圆、细胞间分离解除后，加入完全培养液终止消化。将消化后的细胞转移至无菌离心管内，使用离心机以1 000 r/min转速离心5 min，吸弃上清液，再加入完全培养液充分混悬，调节细胞浓度至105/mL后转移至新的培养皿，加入8 mL完全培养液进行孵育，每24～48 h更换1次培养基，光镜下观察细胞生长状态，每3～4天传代1次。实验分为皂角刺组与阴性对照组。皂角刺提取液使用皂角刺提取物充分混悬于完全培养液制备而成。

1.2.3 MTT比色法检测鼻咽癌细胞增殖 取对数期生长的细胞，用胰蛋白酶液进行消化分离，转移至无菌离心管内，调节细胞浓度为5×104/mL后转移接种于96孔培养板中，每次共接种3板，分别标记后置于培养箱中孵育12 h，光镜下观察细胞贴壁后吸弃培养液，每张培养板内分为10组，其中8组为皂角刺组，每组设置4个复孔，分别加入浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL的皂角刺提取液；2组为阴性对照组，每组设置4个复孔，加入完全培养液；剩余孔内加入PBS液作为调零组。将处理完成的3块孔板置于培养箱中继续孵育。分别于加入药物的12、24、48 h后各取一块板，吸弃孔内溶液，每孔加入MTT溶液10 μL、完全培养液100 μL，置于培养箱内孵育4 h后吸弃孔内液体；再予每孔加入150 μL DMSO溶液，置于微孔板摇床以90 r/min摇匀10 min。待结晶完全溶解后，在室温条件下(20～26 ℃)将96孔板用酶标仪以波长490 nm进行比色，测定每孔的吸光度(OD)值。采集数据结果并计算增殖抑制率，增殖抑制率(%)=[1-(皂角刺组OD值-调零孔OD值)/(阴性对照组OD值-调零孔OD值)]×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测鼻咽癌细胞凋亡 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶液进行消化分离，调整细胞浓度为4×105/mL后，使用移液器以每孔2 mL转移接种于6孔培养板，置于培养箱中孵育24 h。光镜下观察孔板内贴壁细胞达90%融合度后吸弃培养液，于皂角刺组孔内加入2、2.5、3 mg/mL皂角刺提取液，阴性对照组孔内加入完全培养液，调零孔加入PBS液，置于培养箱孵育48 h，光镜下观察细胞贴壁生长后消化并收集细胞；予PBS液重悬洗涤并使用离心机以1 500 r/min离心10 min，重复2次；再向每支离心管内分别加入200 μL Binding Buffer液、10 μL Annexin V-FITC液、5 μL PI液轻柔混匀，室温下(20～26 ℃)避光孵育，10 min后进行流式细胞仪检测。采集数据并计算凋亡率，总凋亡率=早期凋亡细胞率(LR区域)+晚期细胞凋亡率(UR区域)。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 MTT法检测鼻咽癌细胞的增殖抑制情况 通过进行MTT比色法检测，结果显示，不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)的皂角刺溶液作用于鼻咽癌CNE-2细胞12、24、48 h后，较低浓度药物组(0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)在作用12、24 h后均对细胞增殖产生抑制效应，在作用48 h后仅0.2 mg/mL浓度药物对细胞增殖产生抑制效应。较高浓度药物组(3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)作用12、24、48 h后均可显著抑制细胞增殖，其增殖抑制率均高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中3.2、6.4、12.8 mg/mL浓度药物作用48 h后对细胞增殖的抑制效应较为明显。根据6次重复实验的结果计算，计算皂角刺提取液作用于鼻咽癌细胞48 h后的半数抑制浓度(IC50)为(2.53±0.25)mg/mL (见表1)。

表1 不同浓度皂角刺提取液作用于鼻咽癌 CNE-2细胞的增殖抑制率

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 流式细胞仪检测结果显示，将浓度分别为2、2.5、3 mg/mL的皂角刺提取液分别作用于鼻咽癌CNE-2细胞48 h后，其总凋亡率分别为(15.61±1.21)%、(22.08±1.70)%、(37.62±2.07)%，结果均高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 不同浓度皂角刺提取液作用于鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡率

3 讨论

皂角刺为豆科植物皂荚的干燥棘刺，分布于广东、广西、河北、山东、河南等地，作为传统中药，在多部古籍中均有记载，如《药鉴》记载皂角刺“主治诸般肿毒恶疮，能引诸品直至溃处，外科之圣药也”，《本草崇原》记载其可“化痰，败毒攻毒”，《本草备要》则论其可“消痰破坚”。近年来通过高效液相色谱法测定皂角刺成分，结果显示皂角刺中化学物质组成以黄酮类化合物为主[9]。李岗等[10]对皂角刺黄酮类化合物进行分离纯化后取得紫铆查耳酮，作用于人乳腺癌细胞后显示出较为明显的细胞增殖抑制作用。曹冉冉等[11]研究发现，皂角刺提取获得的槲皮素、二氢黄酮醇类化合物等对肝癌 HepG2细胞、肺癌 A549 细胞和食管癌 EC109 细胞均表现出抑制增殖作用。对于中草药抗肿瘤作用机制的研究有多项研究结果，YI等[12]使用皂角刺经乙醇提取物进行体内及体外实验，发现其可以通过降低促血管生成蛋白、内皮素-1和基质金属蛋白酶-2的表达，达到抑制肿瘤细胞侵袭、肿瘤组织相关血管生成的效果，对肿瘤组织的增殖及发展产生抑制作用，并呈现较好的量效关系。龙玲等[13]发现肿瘤细胞的增殖抑制与细胞核抗原PCNA及突变型P53蛋白表达的调节有关。RAYCHAUDHURI等[14-15]学者研究显示肿瘤细胞的增殖抑制与血清Trk水平的调节有关，李哲等[16]则研究发现抑制作用与TNF-α/STAT3通路的激活相关。本研究使用皂角刺提取液对鼻咽癌细胞作用后显示，在一定的浓度及时间范围内，皂角刺提取液对体外培育的鼻咽癌CNE-2细胞的增殖均有抑制作用；干预48 h后，3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL的皂角刺提取液对鼻咽癌细胞的增殖抑制率分别达到(89.61±1.88)%、(96.99±0.66)%、(93.88±1.24)%、(84.15±0.86)%，结果明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05～P<0.01)，而较高药物浓度组(3.2、6.4、12.8、25.6 mg/mL)的抑制细胞增殖效应较为明显。表明皂角刺提取液能够抑制鼻咽癌细胞CNE-2的增殖，并且作用48 h后抑制增殖效应较为明显。本研究通过流式细胞仪检测分析，发现一定浓度范围内的皂角刺提取液均能诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡，3 mg/mL皂角刺提取液作用48 h后，细胞凋亡率为(37.62±2.0%)，明显高于阴性对照组凋亡率(4.64±0.60%)，表明皂角刺提取液能够诱导鼻咽癌细胞CNE-2凋亡。凋亡是细胞受基因调控的自身消解过程，是复杂的连锁反应，涉及多个信号转导、通路调节及多种物质释放，一般认为其机制与抗凋亡基因Bcl-2和促调亡基因Bax转录合成的相关蛋白量以及比例有关，何峰等[17]研究发现皂角刺含药血清通过调节凋亡基因 Bcl-2、Bax的表达从而诱导直肠癌细胞凋亡。

综上所述，本实验结果表明皂角刺提取液可抑制鼻咽癌细胞CNE-2增殖，并可诱导其凋亡。目前尚未得知皂角刺提取液对鼻咽癌细胞抑制增殖与诱导凋亡作用的机制，可进一步深入研究体内环境下皂角刺对肿瘤生长的影响，及组织内肿瘤相关标志物含量的变化。