吴常伟，董 红

（1.首都医科大学燕京医学院，北京 101300；2.湖北医药学院附属东风口腔医院，湖北 十堰 442000）

遗传性牙本质发育缺陷性疾病是一类累及乳牙或恒牙，主要有两大类：一类为牙本质发育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI），另一类为牙本质发育不良（dentinogenesis dysplasis，DD）。DGI 临床上有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种表型，DD 有Ⅰ型和Ⅱ型两种表型。DGI-Ⅰ与成骨不全相关的遗传性牙本质缺陷，DGI-Ⅱ、DGI-Ⅲ和DD-Ⅱ是独立的遗传性牙本质缺陷[1-3]。最常见的是DGI-Ⅱ（OMIM 125490），患者乳牙、恒牙均受累，尤以乳牙更严重，牙本质呈现特殊的乳白色使牙齿外观为半透明乳光色，因此又称为遗传性乳光牙本质（hereditary opalescent dentin），人群中的发病率为1/8000～1/6000，外显率几乎100%，具有高表达性和低频率新生突变。组织学观察：牙本质小管稀疏、排列也不规则，牙本质矿化程度明显下降；沿釉质生长线釉质中断处可发生牙釉质断裂[4-7]。目前研究认为，牙本质涎磷蛋白基因（dentin sialophosphoprotein，DSPP）是DGI-Ⅱ的致病基因。本研究针对牙本质发育异常、临床上确认为遗传性牙本质发育不全Ⅱ型的两个独立家系进行DSPP 基因检测分析，以进一步阐明DSPP 基因突变与牙本质发育异常之间的关系，扩大牙本质发育异常的DSPP 基因突变谱。

1 材料与方法

1.1 样本来源 两个家系来自湖北省十堰市4 代21人，患者牙齿呈半透明浅蓝色至棕黄色，釉质剥脱，牙本质较软，牙冠磨损严重，X 线片显示髓腔和根管狭窄或闭塞，乳牙、恒牙均受累。但无成骨发育不全症状和听力丧失，确诊为遗传性牙本质发育不全Ⅱ型。征得患者和家属同意采集两个家系成员血样，家系1 采集血样8 份，其中患者3 份；家系2 采集血样1 份，即先证者血样。用一次性末梢采血针采血，FTA 洗脱卡（Whatman Cat No.WB120412）收集血样，取100 μl 末梢血加入FTA 洗脱卡圆圈的中心位置，血样自动向外扩散，含样本的位置由粉色转变为白色，80 ℃干燥30 min 后室温保存，采样时间2017 年10 月。

1.2 基因组DNA 提取 ①用直径2 mm 的打孔器对FTA Elute 卡打孔获取小圆片，转移至1.5ml EP 管；②向EP 管中加入500 μl 无菌水，混悬3 次，5 s/次，立即将EP 管中的水吸出；③使用无菌枪头将EP 管中的小圆片转移至0.5 ml EP 管中，加入30 μl 无菌水至0.5 ml EP 管；④将0.5 ml EP 管放至加热器中98 ℃30 min；⑤混悬均匀后，将小圆片用枪头挑出，EP 管中的溶液即为洗脱下来的基因组DNA。

1.3 PCR 引物设计合成 人类DSPP 基因序列从NCBI 网上获取（Genbank 序列号AF163151.2），引物设计覆盖DSPP 基因的5 个外显子及临近区域。依据扩增长度和测序要求，将DSPP 基因外显子1、2各一个片段，外显子3、4 一个片段，外显子5 分成中间重叠的4 个片段。引物由北京新时代科技有限公司合成，PAGE 纯化，使用前加双蒸水至引物浓度为10 μmol/L，见表1。

表1 DSPP 基因编码区引物序列

1.4 PCR 扩增 PCR 反应体系为50 μl，上、下游引物各1 μl，基因组DNA 0.8 μl，2×Taq plus PCR MasterMix（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）25 μl，ddH2O 补充至50 μl。PCR 反应程序为为94 ℃预变性5 min，然后按94 ℃40 s，56 ℃～58 ℃50 s，72 ℃2 min，循环35 次，在72 ℃8 min。

1.5 扩增产物鉴定与回收 反应结束取6 μl PCR 产物，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段。切胶回收PCR 产物的片段用天根生化科技（北京）有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒说明进行。

1.6 扩增产物测序分析 测序工作由由北京新时代科技有限公司完成，测序结果均经双向测序证实。用Chromas 软件查看测序结果，DNA 和蛋白质序列比对用BLAST 软件分析。

2 结果

2.1 扩增产物鉴定 两个DGI-Ⅱ家系9 个样本的DSPP 基因编码区除外显子5 中的高度重复序列（Exon5-3）外的6 个片段均成功扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与其大小一致。

2.2 扩增产物测序分析 两个家系DSPP 基因编码区的扩增片段中存在3 个碱基替换：外显子4 的c.847G＞A（p.D243N）、c.1017A＞G（p.S299S）和外显子5 的c.2091C＞T（p.G657G）。外显子4 的c.847G＞A（p.D243N）的情况在患者和未患病的家庭成员中都存在，没产生遗传学效应属于中性突变，外显子4 的c.1017A＞G（p.S299S）和外显子5 的c.2091C＞T（p.G657G）属于同义突变，见图1～图3。

图1 外显子4 的第243 密码子G>A 的置换

图2 外显子4 的第299 密码子A>G 的置换

图3 外显子5 的第657 密码子C>T 的置换

3 讨论

DGI-Ⅱ是一种常染色体显性遗传病，其致病基因DSPP 位于4q22.1，结构基因DNA 序列全长9944 bp，由5 个外显子和4 个内含子组成[8，9]，DSPP基因编码1301 个氨基酸的DSPP 蛋白，是牙本质中主要的非胶原蛋白，DSPP 基因的表达具有组织特异性，主要在成牙本质细胞和成釉质细胞中表达，也在其他器官也有不同程度的表达。DSPP 蛋白经切割产生大小不同、功能各异的两个片段：牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）和牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP），其中外显子2-4 编码DSP 的N 端，外显子5 编码DSP 的C 端和DPP[10，11]。DSP 蛋白是一种糖基化蛋白，大部分糖基是涎酸，因此被命名为牙本质涎蛋白，在牙本质基质中DSP 占牙本质非胶原蛋白总量的5%～8%，在牙本质发育的矿化过程中作用很小。DPP 牙本质基质中主要的非胶原蛋白，约占牙本质非胶原蛋白总量的50%。DPP 的重要特征是富含丝氨酸和天冬氨酸,是体内酸性很强的蛋白，而且多数丝氨酸磷酸化，组成大量次数不同的DSS、DS 的重复序列，高含量的天冬氨酸和磷酸丝氨酸使DPP 蛋白带有大量的阴离子，并与钙离子有高强度的亲和力。DPP 蛋白对牙本质形成和矿化起主要作用：与Ⅰ型胶原纤维结合集中于矿化前沿控制羟基磷灰石晶体的起始，在矿化过程中与其他蛋白结合在羟基磷灰石结晶表面控制晶体的形状和大小[12，13]。目前在不同人群中发现DSPP 基因的40多个致病基因突变中位于DSP 编码区多数为错义突变或无义突变[14，15]；位于DPP 编码区的多为移码突变[16-19]。根据上述突变可以大致推测，DSP 编码区的碱基突变可能干扰DSPP 蛋白的运输与加工，最终影响牙本质的形成；DPP 编码区的移码突变可能破坏牙本质成熟的整个过程。

本研究中，两个DGI-Ⅱ家系DSPP 基因测序结果显示突变均位于DSP 编码区：外显子4中c.847G＞A（p.D243N），该突变在DGI-II 家系正常成员和患者中均存在，即氨基酸的改变并不影响DSPP 蛋白的功能，属于中性突变；外显子4：c.1017A ＞G（p.S299S）和外显子5：c.2091 C ＞T（p.G657G）属于同义突变。因此，以上3 个碱基替换均表现为单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。

人类基因组计划虽然顺利完成，但发现仍存在大量的未解之谜。随着基因突变产生多种多样的遗传变异不断引入人类基因库，导致遗传多态性。人类基因组中常见的遗传多样性有SNP、插入缺失多态性、拷贝数多态性和倒位多态性等[20-22]。其中SNP数量多、分布广、遗传稳定，作为第三代的SNP 遗传标记技术应用广泛。利用SNP 遗传标记进行遗传学研究，如不同人种的眼睛虹膜颜色差异是由相关基因中的SNP 所决定；利用SNP 遗传标记也进行疾病与基因关联的医学研究，致病基因定位、克隆与鉴定、疾病的基因诊断和精准医疗[23]；此外SNP 遗传标记普遍用于司法的亲子鉴定。上述外显子4 中c.847G＞A（p.D243N）突变是一个突变热点，可作为SNP 遗传标记[6]。

相较常规的核酸提取方法，Whatman FTA 卡的最大优势就在于集样本采集、保存、运输及核酸下游处理于一体。FTA 卡分为洗脱卡和非洗脱卡，基于不同的需求应用和下游处理方法选择具有特定功能的FTA 卡。本研究使用FTA 洗脱卡，血样加入滤膜上被裂解，蛋白质被结合在纤维基质上，室温干燥条件可以长时间保存，而DNA 直接被洗脱以溶液形式保存。相较于常规的DNA 提取技术，此方法提取DNA 快速、简便、高效，利用FTA 卡进行样本采集和核酸洗脱不失为可推荐的常规核酸提取替代方法。

综上所述，对两个DGI-Ⅱ家系的DSPP 基因检测所发现的三个碱基置换均表现为单核苷酸多态性,该研究为DGI-Ⅱ致病基因克隆鉴定、实施精准医疗奠定基础。虽然DSPP 基因突变检测技术成熟，但特定突变与临床症状的相关性和具体机制仍不明确，DSPP 基因中的高度重复序列区域或者基因以外区域是否存在符合DGI-Ⅱ表型的基因突变有待进一步研究。