王 颖，刘晓艳，闵 勇，周荣华，饶 犇

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

蛋白酶是一类水解蛋白质肽链的酶，广泛存在于微生物、动物内脏和植物茎叶、果实中［1］。早在20世纪初，美国首次将木瓜蛋白酶用于啤酒的澄清处理，而在20世纪30年代第一次将微生物蛋白酶用于食品行业［2］，随着科技水平的提高，越来越多的蛋白酶被发掘出来，并被广泛应用于各行各业，如食品加工、皮革制造、洗涤剂以及分子生物研究等领域［3-5］。

蛋白酶K是蛋白酶的一种，属于碱性丝氨酸蛋白酶类，来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium al⁃bumLimber）。首次由Hennrich等于1973年报道，因其能降解角蛋白，故命名为蛋白酶K；1974年Ebeling等［6］通过凝胶过滤大致确定其分子质量为（18 500±500）Da，等电点（pi）为8.9，最适pH在7.5～12.0，是一种碱性蛋白酶。蛋白酶K的蛋白序列由Jany等［7］于1985年报道，晶体结构由Pahler等于1984年初次报道，蛋白质准确大小由Gunkel等［8］于1989年报道，蛋白酶K的基因有2个外显子编码，含有一个63 bp长的内含子；蛋白质由15个氨基酸组成的信号肽、90个氨基酸组成的前导肽和279个氨基酸组成的成熟肽组成［7］。蛋白酶K具有2个Ca2+结合位点，若用乙二胺四乙酸螯合蛋白酶K中的Ca2+，处理3 h其活性降低50%，而加入Ca2+复性处理，其酶活只有初始酶活的28%；此外，其成熟体还含有典型的丝氨酸蛋白酶类催化三联体结构（Asp 39-His 69-Ser 224）和两对二硫键［8］。有研究指出，蛋白酶K对尿素具有较强的耐受性，低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）对其活性影响较低，高浓度影响较大，PMSF对其活性具较强的抑制作用［7，8］。

目前对蛋白酶K的研究主要集中在提高蛋白酶K活性、产量，以及其在各行业中的应用。本研究通过文献调研与在线软件TSpred预测对蛋白酶K活性具有潜在影响的3个氨基酸残基位点，对这些位点进行定点诱变，并将这些突变基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中进行表达，对表达得到的蛋白质进行分析，筛选比酶活和热稳定性均得到提高的蛋白酶K突变体。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

Escherichia coliTop-10、载 体pPicZαA、酵 母GS115均为Invitrogen公司产品。大肠杆菌（Escherich⁃ia coli）使用LB培养基培养，毕赤酵母使用BMGY、BMMY培养基培养，具体配方见Invitrogen手册。

1.2 蛋白酶K表达质粒的构建及突变体的构建

从NCBI上面查询到蛋白酶K序列PK（GenBank：P06873.2），在上海生工进行了基因合成，利用2个酶切位点EcoRI和NotI将PK克隆至pPicZαA表达载体上，得到重组质粒pPicZαA-PK。蛋白酶K突变体的构建主要是根据具体的氨基酸突变位点，在引物上引入突变碱基，然后利用PCR的方法对基因进行点突变，分别得到突变质粒pPicZαA-PK108、pPicZαAPK199和pPicZαA-PK238。

1.3 蛋白酶K在毕赤酵母中的表达

在大肠杆菌中构建好表达质粒，进行酶切和测序鉴定，然后大量提取质粒，利用PmeI进行线性化，电转化毕赤酵母感受态，然后挑取重组子进行摇瓶发酵，电转换条件和摇瓶诱导条件均根据Invitrogen手册实现。

1.4 蛋白酶K及其突变体蛋白活性定义及测定

在一定温度和pH条件下，在1 min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为1个酶活单位，以U表示。蛋白酶K在一定温度和pH条件下，水解酪蛋白产生含有酚基的酪氨酸，在碱性条件下，可将Folin试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酪氨酸的含量成正比。通过在680 nm处测定其吸光度，得到酶解产生酪氨酸的量，进而计算蛋白酶K的活力。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶K表达质粒p Pic ZαA-PK的构建

以上海生工合成好的蛋白酶K基因为模版，用引物PKF和引物PKR进行PCR扩增获得蛋白酶K基因（图1），然后用限制性内切酶EcoRI和NotI分别处理载体pPicZαA和PK片段，连接克隆后得到重组质粒，命名为pPicZαA-PK。

图1 PCR扩增蛋白酶K基因

2.2 蛋白酶K突变体表达质粒的构建

根据蛋白酶K氨基酸序列，通过网站（http：//co⁃spi.iiserpune.ac.in/TSpred/）对其活性位点进行了分析，选取了3个位点的氨基酸（108I、199L、238M）进行饱和突变，其中突变位点氨基酸密码子根据毕赤酵母蛋白表达密码子偏爱性进行了优化。例如，将蛋白酶K基因第108位I突变成G，用引物PKF、PK108F、PK108R、PKR（表1）对蛋白酶K基因进行搭桥PCR得到目的片段PK108，然后将该片段克隆至pPicZαA载体上，命名为pPicZαA-PK108，根据该方法，还构建了pPicZαA-PK199和pPicZαA-PK238。

表1 用于构建野生型及突变体的引物

2.3 蛋白酶K及其突变体重组子的转化及筛选

将蛋白酶K及其突变体质粒用SacI线性化，纯化后电转化Pichia pastorisGS115感受态细胞，涂布MD平板，然后酪素底物平板筛选，如图2所示，选取水解圈大的菌株进行下一步试验。

图2 酪素平板筛选蛋白酶K重组子

2.4 蛋白酶K的摇瓶表达

将筛选到的蛋白酶K重组菌株进行摇瓶表达，先用200 mL BMGY培养基富集培养至OD600nm为8～12（40～48 h），离心（4 000 r/min，5 min）弃上清液，加入50 mL BMMY培养基重悬，加入1%体积甲醇进行诱导，诱导72 h，每12 h加1次甲醇。待诱导结束后，离心（6 000 r/min，5 min）收集培养基上清液，用0.22μm滤膜过滤4℃短期保存，并通过SDS-PAGE检测蛋白酶K的表达情况（图3），之后用BCA试剂盒对发酵液的蛋白质浓度进行测定，结果显示其浓度为1.5 mg/mL。

图3 不同诱导时间蛋白酶K的表达量（SDS-PAGE检测）

2.5 蛋白酶K及其突变体的性质对比

比较了蛋白酶K野生型菌株和3个突变菌株在最适条件下（pH 5.0、40℃）的比酶活变化，结果（表2）表明，第108位氨基酸的突变可以显著提高蛋白酶K的活性，其他2个位点的突变则起了负效应；除此之外，还比较了几个突变子在50℃的热稳定性，突变子pPicZαA-PK108显示出了更高的热稳定性，该突变子比野生型表现了更好的应用前景。

表2 野生型蛋白酶K及其突变体的酶活性比较

3 小结

林伯氏白色念球菌来源的蛋白酶K（EC3.4.21.64），自1973年首次被发现以来，有研究者对其结构、性质进行了研究报道［5］，并实现了蛋白酶K的异源表达（主要是大肠杆菌和毕赤酵母）。此外，研究者们还对如何提高蛋白酶K的表达量、比活性，以及在研究中的最适用量与处理时间（如在原位杂交中的最适用量与处理时间）等方面进行了研究［6-8］，极大程度地促进了蛋白酶K在工业与科研中的应用。

本研究首先获得了野生型的蛋白酶K表达菌株，然后通过软件预测得到了对其热稳定性具有潜在影响的3个氨基酸残基位点，对它们进行了点突变，分别在毕赤酵母GS115中进行了分泌表达，通过筛选获得了一个热稳定性提高了30%，比活性提高约50%的蛋白酶K突变体pPicZαA-PK108。这对蛋白酶K在工业上的应用起到了一定的促进作用，如可以减少蛋白酶K在洗涤剂、食品加工中的用量，降低生产成本；此外，也可提高污水中病毒的灭活效率，减少环境污染。