郑娇莉，姚经武，黄大野，杨 丹，王蓓蓓，曹春霞

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

虾稻共作是一种新型的绿色养殖模式，利用稻田浅水环境和冬闲期进行克氏原螯虾养殖，水稻种植过程中减少化肥和农药的使用［1，2］。虾稻共作模式下春季克氏原螯虾生长旺盛、养殖密度高、投饵量加大，导致池塘底质环境急剧恶化，有机物腐败大量耗氧，并产生硫化氢、氨氮和亚硝态氮等有毒有害物质，从而导致克氏原螯虾免疫力降低，虾病广泛暴发［3-5］，底质改良被认为能够有效改善虾稻共作养殖环境［4］。

微生物修复（Microbial remediation）是指利用微生物的吸收、转化、降解作用清除环境中污染物的一个受控或自发的过程［6］。微生物技术广泛应用于水产养殖环境的改良和修复，微生物菌剂能够抑制水体中有害微生物的生长、分解残饵废料和动物排泄物等有机质、维持养殖水体微生态平衡、增强养殖动物免疫力和促进生长等功能。然而由于中国水产养殖环境变化很大，养殖种类丰富，微生物菌剂在使用过程中存在针对性和适应性差等缺点，影响使用效果，因此从养殖环境筛选本土益生菌，开展本土菌株在养殖池塘污染调控及有益菌制剂的研发受到重视［7-9］，从南美白对虾养殖池塘中分离筛选出1株凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulan），并研究了该芽孢杆菌的生长特性［10］，闫法军等［8］从刺参养殖池塘中筛选出3株低温降解菌，其对氨氮的去除率均高达95%以上，去除饵料浸出液中的COD为21.0%～50.0%，李步先等［9］将虾蟹混养池塘底泥中筛选的4株本土菌制备成混合菌剂，使用5 d后对COD的降解率达70%。

本研究针对虾稻共作田的环境改良需求，从湖北省典型虾稻共作环境中分离有机质降解菌，研究菌株的生长特性和降解性能，评价其应用前景，为虾稻共作养殖环境的微生物修复提供菌种资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

于2020年6月采集自湖北省不同年限、不同地区的虾稻共作田土壤样品，使用土钻采集5～10个表层20 cm土壤样品，混匀后放入4℃冰箱保存。采样点样品信息如表1所示。

表1 采样点样品信息

1.2 有机质降解菌的分离和筛选

1.2.1 培养基配制1）富集培养基配方。取30 g虾饲料充分研磨后加1 L无菌水，振荡摇匀，密封后浸泡48 h以获取上清液饵料的浸出液，离心后取出上清液进行抽滤，重复此操作2～3次，取上清液，调节pH 7.8，分装灭菌。2）分离培养基。富集培养基1 L，琼脂25 g，pH 7.8，121℃，灭菌后倒平板。

1.2.2 样品处理 取底泥与无菌的生理盐水以1∶9的比例进行混合，充分混匀后取上清液放在4℃冰箱里保存备用。

1.2.3 富集驯化 将制备好的样品液接种于10 L无菌离心管，摇匀后90℃水浴20 min，尽可能除去其他微生物。然后分别将水浴处理后的各样品液接种到富集培养基中，恒温振荡培养7 d，得到样品的初始富集菌液。按1∶10的比例接种初始富集菌液于100 mL驯化培养基中继续振荡培养7 d，如此反复6个周期。

1.2.4 分离纯化 取最后一次的富集液，采用平板涂布法，在分离培养基上进行菌株分离，涂布好后恒温培养24～48 h，后挑去单菌落，在分离平板上进行划线培养，直至获得纯化菌株，进行斜面划线并将各菌株编号保种。

1.2.5 菌株筛选 取10 mL活化菌于无菌离心管中，90℃水浴20 min，取水浴后菌液，采用平板划线法，挑选24 h内生长较好的菌株。试验以富集培养基作为菌株降解溶液，以不加菌的富集培养基作为对照，测定菌株的有机质降解率，筛选降解率高的菌株。

1.3 菌株16S测序鉴定

采用通用引物对（27F/1492R）对菌株进行PCR，将PCR产物送测序公司测序，16S测序结果在NCBI上进行比对，对菌株进行鉴定。

1.4 有机质降解菌的生长和降解特性

挑取单菌落接种于LB培养液中，30℃、180 r/min过夜培养后，按照1%的比例接种于富集培养基中，每隔4 h取样测定菌液的OD600nm，获得不同菌株的生长曲线。

将培养过夜的LB菌液按照1%的比例接种于富集培养基中，分别于1、3、5、8 d后取样测定培养基COD含量，从而获得菌株的降解曲线。

1.5 有机质降解菌的胞外酶活性测定

胞外酶活性测定培养基参考郭灿灿等［11］的方法，用牙签将摇培的LB培养液菌株点接在预先准备好的4种筛选平板上，每个处理4次重复，26℃培养48 h后测定水解圈直径和菌落直径。对于蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，可以通过比较水解圈直径/菌落直径数值来初步判断菌株分泌胞外酶能力的大小，该值越大，菌株产酶能力越强；脂肪酶则是通过比较菌落中形成的红色斑点区的大小来判断，红色斑点区越大，产脂肪酶能力越强。

1.6 数据分析

采用SPSS17.0软件进行数据统计，通过单因子方差分析和Duncan多重比较进行数据分析。各处理之间以P<0.05作为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 有机质降解菌的分离和筛选

经富集驯化，共分离纯化获得36株菌株，降解活性如图1所示。其中，菌株编号2、7、20、26、28、35具有较高的降解活性，这些菌株分别分离自咸宁20年虾稻田土壤、丫角4年虾稻田土壤，样点信息如表2所示，将菌株分别命名为OC-1至OC-6。

表2 初筛有机质降解菌基本信息

2.2 有机质降解菌的分类

对这些菌株进行16SrDNA序列分析，由图2可以看出，OC-1至OC-6菌株均为芽孢杆菌，其中，OC-1、OC-2、OC-3 3株细菌均归属于阿氏芽孢杆菌（Bacillusaryabhattai）；OC-4初步鉴定为弯曲芽孢杆菌（Bacillusflexus）；OC-5初步鉴定为黄海芽孢杆菌（Bacillus marisflavi）；OC-6属于芽孢杆菌（Bacillussp.）。

图2 菌株OD-1至OD-6基于16Sr DNA序列的系统发育树

2.3 有机质降解菌的生长特性

从6种菌株的生长曲线（图3）可以看出，OC-1、OC-3、OC-4和OC-6生长更为迅速，在接种后16 h即可达到稳定期，而OC-2生长速率较低。值得注意的是OC-5菌株由于具有凝集特性，所以OD600nm测值偏低，在8～24 hOD600nm为0，需要用其他方法检测其生物量。

图3 有机质降解菌的生长曲线

2.4 有机质降解菌的氨氮去除特性

从表3可以看出，各菌株对氨氮有一定的去除效果，氨氮去除效果为28.89%～67.21%，培养4 d后OC-4和OC-6去除效果较低，分别为28.89%和30.67%，其余菌株的去除效果为50%左右。

表3 有机质降解菌的氨氮去除特性 （单位：%）

2.5 有机质降解菌的降解特性

菌株能够快速降解饵料培养基中的有机质，如图4所示。OC-1至OC-3降解速率较高，培养1 d降解率即达70%左右，3 d达90%以上，随着时间逐渐增加，降解率反而有所下降，这可能是由于这些菌株生长快速，高浓度的菌株分泌一些有机代谢产物，从而增加了培养基中有机质含量。OC-4至OC-6降解速率相对较低，培养1 d降解率为50%左右，之后随着培养时间的增加降解率逐渐升高，OC-4至OC-6降解率在培养3 d即达85%以上。

图4 有机质降解菌的有机质降解特性

2.6 有机质降解菌的产酶能力

对各菌株的产酶特性进行研究［11］，结果见图5、图6、图7。6株菌株均能产生胞外蛋白酶，以水解圈/抑菌圈来反映各菌株的蛋白酶活性，发现OD-1至OD-3具有相对较高的蛋白酶活性（图5）；仅OD-1至OD-3具有产胞外淀粉酶的能力，3种菌株淀粉酶活性相差不大（图6），而OD-4至OD-6没有产胞外淀粉酶的能力；OD-1、OD-2和OD-4具有产胞外纤维素酶的能力，其中OD-4产胞外纤维素酶活性的能力更高（图7），其余3株菌种不产胞外纤维素酶；此外，6种菌株均不产脂肪酶。

图5 有机质降解菌产胞外蛋白酶特性

图6 有机质降解菌产胞外淀粉酶降解特性

图7 有机质降解菌产胞外纤维素酶降解特性

3 小结与讨论

残饵是水产养殖内源性污染的主要来源，由于养殖过程中饵料利用率最高不到70%，大量饵料不能被养殖动物摄食，并不断在底泥中积累，这些有机物在分解过程中需消耗大量的溶解氧，产生硫化氢、氨氮等有害物质，严重污染水体，易导致疾病暴发，甚至养殖生物死亡。在虾稻共作田中，春季投饵也导致水体溶氧骤降，氨氮和亚硝态氮等有机质含量增加等问题。水产养殖微生态制剂因其具有分解有机物、降低氨氮和亚硝氮浓度、抑制有害微生物的繁殖、改善养殖生态环境的作用，已被广泛使用。本研究从长期虾稻共作田中分离了6株有机质降解菌，并研究了菌株的生长特性、有机质降解特性和产酶能力。

从洪湖、后湖和咸宁等地长期虾稻共作养殖环境（连续虾稻共作12～20年）均分离到属于阿氏芽孢杆菌的有机质降解菌，且这些菌株降解活性高，能够产生多种胞外酶，这表明这类细菌可能在虾稻共作田中具有更广泛的适应能力。值得注意的是，从丫角4-3分离的黄海芽孢杆菌具有凝集聚团的特性，细菌在培养液中形成颗粒性沉淀，细菌的自凝集能力与细菌表面疏水性直接相关［12］。自凝集能力对细菌的生存有重要意义，通过自凝集达到一定的数量以形成生物被膜或黏附到宿主黏膜表面来发挥生物学功能［13］，底泥是养殖环境重要的内源性污染来源，若通过细菌自凝集直接作用于底泥污染物，可有效改善养殖环境，该菌株的应用价值还需要进一步研究。

本研究中分离的芽孢杆菌具有高效降解饲料浸出液有机质的能力，其中OD-1至OD-3培养1 d降解率即达70%以上，培养3～5 d后，OD-1至OD-5的降解率最终能达90%左右，高于从其他养殖环境中分离的有机质降解菌，如从罗非鱼养殖系统中分离的有机质降解菌在培养3 d后对饲料浸出液中有机质的降解率为49%～53%［14］。从对虾养殖池塘中筛选的有机质降解菌在培养5 d内对虾饵料培养基的降解率为59%～79%［15］。这可能是由于本研究中有机质降解菌分离自长期虾稻共作养殖环境（连续虾稻共作时间12～20年），长期养殖使得底泥积累了丰富的有机质，从而富集大量有机质降解菌。本研究中有机质降解菌能利用饲料浸出液有机质进行快速生长［8］，大多在接种8 h后进入对数期，在12～16 h即进入稳定期，此外有机质降解能力与细菌的产胞外酶能力有关，OD-1、OD-2能够产多种胞外酶，这或许能够解释其快速而高效的降解能力，而仅能产蛋白酶的OD-6，其降解速率则相对较低。

本研究筛选6株有机质降解菌，经鉴定均为芽孢杆菌，其中，OD-1、OD-2能够快速而高效地降解饵料培养基中的有机质，这可能与其能够分泌较多种类胞外酶能力有关，这2种菌株具有一定的应用潜力。