侯绍蔚，米希婷，武晓华 ,赵爱玲

（1.山西大同大学医学院，山西大同 037009；2.大同市第五人民医院，山西大同 037009；3.山西大同大学第一临床医院，山西大同 037009）

皮肤是人体最外层的屏障，与环境直接接触，可以通过感知环境来调节局部和全局的内稳态[1]。皮肤老化是一种复杂的生物现象，可分为内在老化和外在老化。面部皮肤老化是一种影响皮肤和面部深层结构的退行性过程，主要由内在(年龄)因素所引起，但也与外在因素有关，尤其是紫外线辐射。内在老化主要是由基因决定的，它通过结缔组织缓慢的、部分可逆的退化来影响皮肤，其方式与大多数内部器官相似。外源性老化，通常称为光老化，由环境暴露引起，主要是紫外线辐射。持续暴露在紫外线辐射下，可以导致胶原蛋白变性，弹性蛋白结构异常，细胞外基质的结构功能和完整性下降，导致皮肤失去光泽和弹性，出现老化迹象，甚至在年轻人中出现过早衰老的表现[2]。其临床特征是干燥、色素沉着、松弛和深层皱纹[3]。

再生医学是一个新兴的领域，其重点是基于细胞和组织的治疗，适用于整形手术，包括皮肤的老化。其机制主要是将未分化的干细胞转化为分化细胞，最终完成重建和修复效果。此外，干细胞能分泌多种生长因子、细胞因子和生物活性分子，刺激组织再生，从这个意义上讲，由于富血小板血浆（plateletrich plasma,PRP）中各种生物因子的存在，如血小板来源生长因子、转化细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子等，可以促进成纤维细胞的活化和胶原蛋白的合成，也被描述为具有再生效应[4]。由于PRP 是自体血小板浓缩物，制备简单，容易获得，在改善皮肤光老化方面有较多研究[5]。本研究将探讨PRP 对光老化Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、氧化应激反应的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

18 只3～4 月龄的健康雄性SD 大鼠，体质量260～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SOD 活性检测试剂盒和丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；CollagenⅠ抗体和CollagenⅢ抗体均购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮肤光老化模型建立

根据文献报道的照射方案并稍作修改进行紫外线照射[6]：大鼠背部剪毛，置于自制的紫外灯照射箱中进行照射，每周照射5 d,连续照射14周。第1周每天照射20 min，第二周增加5 min,从第30 d开始保持每天照射30 min直至建模结束。

1.2.2 PRP的制备

腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉大鼠，用预先吸入0.3 mL 3.2%枸橼酸钠溶液的注射器穿刺至左心室收集动脉全血3 mL，共计60 mL。PRP的制备过程包括2个离心步骤。将全血在18 ℃下以300 r/min的速度离心5 min，收集全部血浆及交界面下3 mm液体，然后将其转移至另一离心管中在18 ℃下以700 r/min的速度离心17 min。在第2 个离心步骤之后，弃去上层3/4液体,剩余液体摇匀即得PRP。加入10%CaCl2和25 IU/mL 人血浆凝血酶进行血小板活化，在37 ℃孵育1 h，在4 ℃下持续16 h。激活的PRP 于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 PRP注射治疗大鼠光老化皮肤

紫外灯照射14 周后,大鼠常规饲养1 周后实施干预。建模大鼠随机分为2 组,每组6 只，分别为生理盐水注射组和PRP 注射组(干预4 周)，正常大鼠(6 只)为对照组。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，在背部照射区域于真皮层内注射1 mL PRP,每只大鼠均匀注射20 个点,每点注射0.5 mL,模型组注射生理盐水，PRP 治疗组注射激活的PRP，正常对照组不注射。

1.2.4 Western bolt法检测皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达

将紫外线照射背部皮肤提取的蛋白(50 μg)用10% SDS-PAGE 不连续凝胶电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。然后分别加兔抗Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和GAPDH（1∶1000）一抗,4 ℃冰箱孵育过夜。次日加相应HRP 偶联的羊抗兔IgG 二抗，室温孵育2 h。加ECL-Plus 显色液显色，使用Bio-Rad 凝胶成像分析仪检测条带强度。结果以检测蛋白条带光密度与GAPDH 的光密度比值表示。

1.2.5 皮肤中氧化应激标志物MDA和SOD的检测

取紫外线照射背部皮肤提取的蛋白，然后分别使用试剂盒检测MDA和SOD的水平。具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 统计学分析

实验数据采用统计学软件Graphpad Prism 5进行分析处理，结果均以来表示，2 组间数据采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 外观变化

紫外灯连续照射14 周后,模型组大鼠背部皮肤出现深大的静态纹和明显的皮肤脱屑和色素沉着。与模型组相比，PRP 治疗组大鼠皮肤外观明显改善，表现为皮肤弹性明显好转，粗大静态皱纹减少，无脱屑和明显色素沉着。

2.2 Western bolt 法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达结果

与对照组比较，模型组大鼠背部皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，PRP 治疗组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显增加（P＜0.05，图1）。

图1 PRP治疗对Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

2.3 皮肤中氧化应激标志物MDA和SOD的变化

与对照组比较，模型组大鼠背部皮肤中SOD 活性明显降低，MDA 含量明显升高（P＜0.01）。PRP 治疗能够显著提高SOD的活性（P＜0.001），减少MDA的水平（P＜0.001，图2），抑制氧化应激损伤。

图2 PRP治疗对MDA和SOD的影响

3 讨论

PRP 是一种从血液中提取的血小板超生理浓度的自体血浆，PRP 中包括800 多种生物活性分子[7]，如活化血小板α颗粒释放的促分裂和趋化生长因子：血小板衍生生长因子、转化生长因子β1、转化生长因子β2、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和上皮生长因子等。这些成分可能通过上调负责细胞增殖和分化、血管生成和细胞外基质合成的基因来影响组织修复和其他细胞事件[5]。血小板浓缩物已用于组织再生[8]。PRP 注射治疗老化皮肤也得到了广泛的应用。吴文伯等研究证实PRP 可以改善大鼠光老化皮肤[9]，本实验也证实了这一结论。我们用紫外灯照射大鼠14 周建立光老化模型，建模完成后PRP 注射组干预4 周，从外观上看，和模型组比较，PRP治疗组大鼠皮肤外观明显改善，皮肤弹性明显好转，粗大静态皱纹减少，无脱屑和明显色素沉着。

光老化皮肤在显微镜下可观察到表皮增生、真皮弹性增生、胶原降解和炎症浸润等特征[10]。紫外线诱导的氧化损伤和炎症损伤已被证实在光老化的发病机制中起重要作用[11]。一般来说，活性氧水平是由抗氧化剂调节的,如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。但是如果氧化/抗氧化系统这个平衡点被紫外线辐射破坏，氧化应激会发生在皮肤深层，导致皮肤细胞成分的氧化损伤，即可导致光损伤、光老化和光癌发生[12]。紫外线照射引起的过量活性氧会激活IkB 激酶导致IkB 磷酸化和核因子-B（nuclear factor kappa B,NF-κB）的活化，从而促进多种促炎细胞因子的产生，如白介素10（interleukin10,IL-10）、IL-6、IL-1 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α），促进细胞坏死和凋亡。同时也会增加基质金属蛋白酶（MMPs）表达，降解细胞外基质成分，引起皮肤松弛、皱纹和红斑，从而导致光老化[13]。由于PRP 中含有大量生长因子，在光老化皮肤处注射PRP，可以促进局部成纤维细胞增殖分化，加快其合成胶原蛋白和其他细胞外基质成分的速度，从而改善光老化皮肤[14]。

在本研究中，为了探讨PRP 治疗光老化皮肤的机制，我们检测了皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达，并且检测了反应氧化应激的两个重要指标MDA含量和SOD 活性。结果表明，光老化皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达降低，MDA 含量升高，SOD 活性降低。PRP 治疗后，氧化应激损伤降低，MDA 含量降低，而SOD 活性升高，同时，皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达升高。

综上所述，PRP 治疗可以明显改善光老化皮肤，促进皮肤中胶原蛋白的合成，其机制可能与降低氧化应激反应有关。但是关于PRP 治疗光老化皮肤的确切机制需要进一步进行深入的研究。