于志娟（通讯作者），王立国

（赤峰市医院妇产科 内蒙古 赤峰 024000）

宫颈癌为全球女性三大常见癌症，发病原因尚不明确，早婚早育、性生活紊乱女性患病率较高。宫颈癌早期治疗具有良好效果，中晚期患者的预后差，故早期发现并治疗是提高宫颈癌生存率的关键，寻找用于宫颈癌早期诊断与预后判断的生物学标记物对临床具有重要意义[1]。LncRNA 在肿瘤发生发展中发挥关键调控作用，参与多种肿瘤发生发展过程，但目前尚未充分研究出NEAT1在宫颈癌中生物学功能。NEAT1 与miR-129-5p 在宫颈癌中作用关系也无明确报道[2-3]。本研究将宫颈癌细胞作为研究，检测Hela 细胞中NEAT1、miR-129-5p 表达情况，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

人宫颈癌（Hela）细胞和正常宫颈细胞来源于AT CC；胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶等购于GIBCO 公司。

1.2 方法

细胞培养与转染：将人宫颈癌细胞株与人宫颈上皮细胞放于DMEM 培养液中，于培养箱中培养。进行LncRNA NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A 转染；将敲减NEAT1 阴性对照（si-con）、敲减NEAT1（si-NEAT1）、miR-129-5p 模拟物、过表达miR-129-5p 阴性对照（miR-NC）按要求转染至Hela 细胞，转染6 h 后更换培养基常规培养，qRT-PCR 检查转染情况，成功后备用[4]。

qPCR 检测：采用TRIzol 法分别提取宫颈癌细胞与细胞总RNA；后通过NanoDrop 检测RNA 浓度与纯度，逆转录制备cDNA。取逆转录产物检测PCR，按试剂盒说明建立PCR 反应体系；PCR 循环参数设置：95 ℃下5 min，3 步反应；94 ℃下变性30 s，60 ℃下退火30 s，45 个循环。结果通过2-ΔΔCt法计算。

Wb 检测宫颈细胞TNFRSF11A 与上皮间质转化相关蛋白表达：提取细胞蛋白后检测蛋白浓度，上样缓冲液中加入萃取蛋白，加热至95 ℃并维持10 min；每孔样品载药量为30 μg，加入10%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白；经聚偏二氟乙烯转膜后将蛋白密封在牛血清蛋白中1 h，加入一抗后在4 ℃下过夜培养；缓冲液冲洗后加二抗于室温下培养；洗膜3 次，加化学发光试剂显影蛋白。

CCK-8 检测癌细胞增殖：将癌细胞接种在96 孔板，于Caski、HeLa 细胞中转染NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A；检测前1 h 每孔加入CCK-8 溶液，培养箱中孵育4 h，用酶标仪检测光密度值。

Transwell 实验检测癌细胞侵袭力：将转染细胞作为研究组，未转染作为对照组；各组细胞经胰酶消化处理，接种在Transwell 小室孔板中，上室加细胞悬液，下室加胎牛血清的培养基，于培养箱中培养后取出小室，擦去微孔膜上室细胞，缓冲液冲洗，固定侵袭并黏附至小室微孔膜下方细胞，结晶紫染色，冲洗小室后干燥，于倒置显微镜观察。

染色流式细胞术检测癌细胞凋亡：选择转染与未转染组Caski、HeLa 细胞培养至对数生长期，冲洗后，混合细胞与预冷缓冲液结合，避光孵育，上机前加PI 染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（± s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用频数表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 宫颈癌组织NEAT1、miR-129-5p 表达

相对于正常宫颈细胞，Hela 细胞中NEAT1 表达上升，miR-129-5p 表达下降（P＜0.05），见表1。

表1 组织NEAT1、miR-129-5p 表达比较（ ± s）

表1 组织NEAT1、miR-129-5p 表达比较（ ± s）

组别NEAT1miR-129-5p正常宫颈细胞1.09±0.142.74±0.29宫颈癌Hela 细胞3.18±0.360.96±0.10 t 8.6119.054 P＜0.001＜0.001

2.2 敲减NEAT1 对宫颈癌细胞影响

si-NEAT1 组Hela 细胞NEAT1 表达低于si-NC 组（P＜0.05）， 细胞活性降低（P＜0.05）；si-NEAT1 组迁移与侵袭细胞数低于si-NC 组（P＜0.05），见表2。

表2 敲减NEAT1 对宫颈癌细胞影响（ ± s）

表2 敲减NEAT1 对宫颈癌细胞影响（ ± s）

侵袭细胞/个si-NC 组3.18±0.31 1.36±0.15 48.64±5.37 47.39±4.16 si-NEAT1 组 1.01±0.08 0.81±0.07 19.95±6.01 13.31±5.71 t 7.56118.56225.314 P＜0.001＜0.001＜0.001组别NEAT1细胞活性（OD490 nm）迁移细胞/个

2.3 过表达miR-129-5p 对宫颈癌细胞影响

miR-129-5p 组Hela 细胞中miR-129-5p 表达高于miR-NC 组（P＜0.05），细胞活性降低（P＜0.05）；miR-129-5p 组迁移与侵袭细胞数低于miR-NC 组（P＜0.05），见表3。

表3 过表达miR-129-5p 对宫颈癌细胞影响（ ± s）

表3 过表达miR-129-5p 对宫颈癌细胞影响（ ± s）

侵袭细胞/个miR-NC 组0.93±0.07 1.42±0.14 51.36±5.14 43.53±3.11 miR-129-5p 组 2.41±0.23 0.85±0.07 18.32±1.15 12.75±1.42 t 9.2516.85431.05234.053 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001组别miR-129-5p细胞活性（OD490 nm）迁移细胞/个

3.讨论

宫颈癌为女性常见恶性肿瘤，病死率高。宫颈脱落细胞检测为宫颈癌筛查的标准方式，能有效降低宫颈癌发病率与病死率，但筛查仍具有一定局限性。由于临床缺少有效早期诊断方法，宫颈癌多发展为浸润性癌症，降低患者生存率。近年来临床已证实LncRNA 的生物学功能，机制涉及DNA 甲基化、多形式组蛋白修饰、RNA 干扰、染色质重构等，通过调控基因转录、转录后调控与表观遗传学等影响靶基因沉默和细胞周期变化，且能影响剪切、翻译方式，进而促进肿瘤发生发展。LncRNA 为新型生物学标记物，表达水平联合癌症病理与预后在临床中得到广泛研究应用。多个研究指出LncRNA MALAT1与宫颈癌发生发展可能存在关联，本研究对LncRNA MALAT1 与宫颈癌的相关性进行研究[5-6]。本研究发现LncRNA MALAT1 表达在癌组织与癌旁组织中差异显著，提示LncRNA MALAT1 与宫颈癌发生发展可能有一定促进作用[7]。miR-129-5p 与多肿瘤发生发展密切相关，外源性miR-129-5p 可抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡并阻断HeLa 细胞周期进展，但miR-129-5p 对宫颈癌侵袭、转移等机制尚不明确。研究显示，miR-129-5p 过量表达能抑制胃癌细胞侵袭与增殖，故miR-129-5p 过表达对宫颈癌细胞侵袭可能有抑制作用[8]。本研究显示miR-129-5p 过表达中miR-129-5p 组细胞中miR-129-5p 表达高于miR-NC 组，迁移与侵袭细胞数低于miR-NC 组，说明抑制miR-129-5p 表达可逆转敲减NEAT1 对宫颈癌细胞活性、迁移侵袭抑制作用[9]。

综上所述，LncRNA NEAT1 可下调miR-129-5p/TNFRSF11 A 轴促进宫颈癌发展，该机制可为宫颈癌治疗提供靶点。