李好文，叶国苍，陈 川

（中国科学院大学深圳医院<光明>结核门诊 广东 深圳 518000）

危害人类健康传染病中结核病占据前位，为全球关注公共卫生社会问题，为国内重点控制重大疾病。我国每年新发结核患者人数为130 万，仅次于印度，位居全球第2 位，为社会造成严重负担[1-2]。据统计，全世界中有1/3 结核病为北京基因型结核分枝杆菌引起[3-4]。作为一类具有相似遗传背景结核分枝杆菌，可依据基因特征不同，将其分为许多亚型，并依次区分不同背景家族株成员[5-6]。我国作为北京基因型菌株高发地区，在北方地区比例高达70%～80%。具有高毒力特点，引起抑制和逃逸宿主免疫，耐药性高，结核复发率高[6-7]。但往往各地研究不一致，为此，文章就深圳市光明区结核分枝杆菌的基因型分布特征及其利福平耐药基因突变情况进行研究，为结核病防控提供依据，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取深圳市光明区中国科学院大学深圳医院2017 年1 月—2019 年12 月结核病实验室基因型毒株532 株，并采取罗氏比例法鉴定耐利福平临床分离株24株及利福平敏感株474 株。

1.2 方法

罗氏培养基、RFP 药敏培养基购自于珠海贝索生物技术有限公司。基因芯片法提取结核分枝杆菌耐药基因，提取结核分枝杆菌DNA，0.9%氯化钠溶液从罗氏培养基上洗脱结核分枝杆菌，80 ℃，30 min 灭火并离心3 000 r/min，10 min，去上清液，加入TE 悬液400 μL，煮沸30 min，12 000 r/min，3 min 取上清液，-20 ℃中保存备检。分离培养菌株悬液20 μL，加入20 μL 结核分枝杆菌裂解液，混匀后并沸水浴10 min，1 000 r/min 离心2 min，留取上清液。PCR 反应管5 000 r/min 离心2 s，并添加已经提取待测样本DNA 4 μL。取两管PCR 反应管，加入阳性质控品、阴性质控品DNA 4 μL，产品使用期间质量控制PCR 按照以下条件进行扩增：50 ℃下2 min，95 ℃下10 min，95 ℃下45 s，68 ℃下60 s，30 个循环，95 ℃下30 s，54 ℃下30 s，68 ℃下60 s，30 个循环，68 ℃下10 min。依据说明书进行杂交、洗膜，结果判读为阳性或阴性菌依据质控品要求，依据显色出现阵列，直接判读是否出现突变。结核分枝杆菌基因分型检测采取间隔区寡核苷酸分型。判定标准：典型性北京家族基因型：杂交信号点位1 ～34 为阴性，未出现黑色点，35 ～43 后9 个点位全为阳性者即全有黑色点出现。非典型性北京家族基因型：35 ～43 点位出现间断或缺失信号，阳性信号黑点不少于5 个。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据处理。计数资料用频数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 424 株结核分枝杆菌临床分离株基因型分析

利福平耐药情况中，北京家族基因群为14 例，占比58.33%，非北京家族基因群为10 例，占比41.67%，见表1。

表1 424 株结核分枝杆菌临床分离株基因型分析

2.2 利福平临床分离株不同基因型的耐药基因变异状况

北京家族、非北京家族中单531、单516 中比较差异存在统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 利福平临床分离株不同基因型的耐药基因变异状况[n（%）]

3.讨论

目前，国内结核病流行状况严峻，耐药及广泛耐药菌株出现为疾病诊断、治疗造成挑战。目前对结核分枝杆菌基因分型、耐药关系有相关研究[8]。对不同地区而言，结核分枝杆菌基因型不同，由于我国地域广阔，基因型分布情况相对复杂，北方地区中以北京基因型株为主要感染基因型，南方地区分布更为复杂[9-10]。深圳市作为靠海城市，目前对结核分枝杆菌基因分型及其耐药关系之间研究较少。因此，分析深圳市结核分枝杆菌基因型分布情况以及利福平耐药情况，对后续防控措施开展上起着重要作用[11]。

通过对深圳市光明区结核分枝杆菌分布情况得出，其中占比最高为北京家族基因群，北京家族基因群为14 例，占比58.33%，非北京家族基因群为10 例，占比41.67%。中国地区中，普遍流行为北京家族基因群，对江苏、青海等其他地区研究证实，其北京家族基因群占比偏高。由于北京家族基因型病原菌毒力较强，易造成治疗失败以及复发。对其耐药菌株检测显示，单531、单516 占比偏高，与非北京家族基因群比较，存在差异性（P＜0.05）。本次研究得出，北京基因型利福平耐药变异绝对数量远远高于非北京型。但由于本次研究开展局限性，对其检测变异位点数据及样本含量存在一定局限，无法准确判断出北京家族基因型是否更易出现耐药基因型及耐药率偏高。也无法证实北京家族所特有变异位点，仍需后续进一步深入研究。

综上所述，深圳市光明区结核分枝杆菌中，北京家族、非北京家族基因群中基因多态性高，与利福平耐药率无显著相关，两者在单531、单516 存在差异。