王凤阁，孙思琪，韩 月，孔钰琳，张绪东

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

原代心肌细胞是探究心血管疾病发病机制以及研制有效新药的重要工具，体外原代培养心肌细胞可以排除神经、体液等因素的干扰[1]，通过对原代心肌细胞培养方法的研究有助于更好地了解心肌细胞的细胞周期[2]、信号转导[3]和基因调控[4]。目前常用的心肌细胞原代培养方法有单一的胰酶消化法和两种酶先后消化的胰酶+Ⅱ型胶原酶法，本研究对这两种原代培养的方法进行比较，并改用两次90 min差速贴壁的方法提高纯度，以期为基础实验原代心肌细胞的培养和研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生24 h内的SD乳鼠(清洁级，由牡丹江医学院医药研究中心提供)。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM培养基、青链霉素购自HyClone公司；胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶、DAPI购于Beyotime公司；Ⅱ型胶原酶、多聚甲醛购自Biosharp公司；兔抗大鼠肌钙蛋白I多克隆抗体购自博奥森生物技术有限公司；FITC标记山羊抗兔IgG抗体、山羊封闭血清购自中杉金桥生物技术有限公司；TritonX-100、PBS购自Solarbio公司，D-hank’s购自Biotopped公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞的分离和培养 24 h内新生SD乳鼠10只，雌雄不拘，随机分为两组，胰酶法组和胰酶+Ⅱ型胶原酶法，每组5只。异氟烷麻醉成功后，超净台中75%酒精浸洗消毒，开胸取心脏。在4 ℃预冷的D-hank’s溶液中剔除结缔组织，剪取心室心尖部，轻轻挤出血液，充分洗涤3次，置于离心管内待消化。

胰酶法组：采用胰酶法处理。将每个心尖组织剪碎至1 mm3，加入2 mL 37 ℃ 预热的0.25%胰酶，置于37 ℃的电热恒温震荡水槽内消化，速度55次/min，消化6 min，取出后使用巴氏管轻柔吹打1 min后，待组织沉淀后收集消化液，经200目筛网过滤，并与等量的完全培养基(含10%胎牛血清)混合终止消化，放置在冰盒上。按照上述步骤消化数次至心肌组织消化完全。

胰酶+Ⅱ型胶原酶法组：采用胰酶+Ⅱ型胶原酶法处理。心尖组织无需剪碎，直接加入4 ℃预冷的0.125%胰酶，充分混匀。将离心管置于4 ℃摇床，速度50次/min，消化10 h后，取出弃掉胰酶，加入4 mL 37 ℃预热的0.08%Ⅱ型胶原酶，置于37 ℃的电热恒温震荡水槽内，速度75次/min，消化6 min，收集每次消化液后经200目筛网过滤并与等量完全培养基混匀。同样按照上述步骤至心肌组织消化干净。

分别对两种方法的滤过液进行离心(1000 r/min，6 min)，将沉淀的细胞在适量的完全培养基中重悬，转移至25 cm2培养瓶中，于细胞培养箱(37 ℃，5% CO2)中进行两次90 min的差速贴壁。收集差速后的细胞悬液，加入新的完全培养基继续培养，待细胞单层融合后进行相关实验。

1.2.2 心肌细胞形态学的观察 倒置显微镜下观察并定期拍照不同时间的原代心肌细胞的生长状态和形态变化。

1.2.3 心肌细胞获得率和存活率的测定 两次差速贴壁后，取适量心肌细胞悬液，与等量台盼蓝混匀后，在显微镜下随机取4个视野，计数并计算原代心肌细胞的获得率和存活率，死细胞胞膜受损被蓝染，活细胞胞膜完整且拒染。心肌细胞获得率=(细胞密度×悬液体积)/心脏个数，细胞存活率=未着色细胞数/(未着色细胞数+蓝染细胞数)×100%，实验重复3次。

1.2.4 心肌细胞的纯度鉴定 心肌细胞在爬片培养第3天时，弃去培养液，温PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，0.3% Triton X-100室温通透15 min，继续用PBS清洗3次，吸水纸吸干后加入山羊血清室温封闭15 min。吸干封闭液后采用cTnT行免疫细胞荧光染色，PBS清洗后，加入DAPI染核5 min，再次进行3次PBS溶液的洗涤，用抗淬灭封片剂封片后，于倒置荧光显微镜下观察并计算细胞纯度。

1.3 统计学方法应用SPSS 23.0统计软件分析，结果以“均数±标准差”表示。组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法获得的心肌细胞形态学的观察及比较两种方法获得的心肌细胞在差速贴壁后均呈圆形或椭圆形，悬浮于培养基中，但在镜下观察到胰酶法较胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离获得的心肌细胞中细胞碎片较多，即死细胞较多；培养至24 h后两种方法获得的心肌细胞基本全部贴壁，多呈梭形或多边形，核仁清楚，单个细胞出现自律搏动，搏动频率不规则，此时在显微镜下可以明显观察到胰酶+Ⅱ型胶原酶法相比于胰酶法获得更多贴壁的心肌细胞；48 h后心肌细胞已完全贴壁生长，伸出伪足，折光性强，呈梭形和不规则形；继续培养至72 h，两种方法获得的心肌细胞聚集成片成簇，同步收缩，节律不规则，搏动频率40～110次/min，这与其他学者培养的细胞形态相似[5-6]。综上所述，两种方法得到的细胞都具有典型的心肌细胞形态，在形态学上无明显的差异，但在细胞产量方面，胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得的贴壁细胞更多，见图1。

图1 倒置显微镜下观察两种方法培养的心肌细胞的形态变化(×100)

2.2 两种方法分离得到心肌细胞的获得率和存活率的比较胰酶+Ⅱ型胶原酶法分离的心肌细胞获得率为(1.21±0.03)×106，明显高于胰酶法(0.65±0.02)×106；胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得的心肌细胞存活率(93.37±0.40)%明显高于胰酶法(86.40±0.36)%，差异均有统计学意义(P<0.01)，故在心肌细胞获得率和存活率方面，胰酶+Ⅱ型胶原酶法优于胰酶法。

2.3 两次差速贴壁后心肌细胞的纯度鉴定对胰酶+Ⅱ型胶原酶法和胰酶法培养3 d后的心肌细胞进行细胞免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察到两种方法培养的心肌细胞的胞浆中cTnT特异性染成绿色荧光，胞核呈蓝色荧光，抗cTnT抗体表达阳性的细胞数占总细胞数目95%以上，表明两种方法培养出的心肌细胞纯度无明显差异，见图2。

图2 两种方法获得的原代心肌细胞的免疫荧光染色(×200)

2.4 两种方法获得心肌细胞所耗时间的比较从取心开始至获得可接种的心肌细胞悬液为止，胰酶+Ⅱ型胶原酶法获得的心肌细胞所耗时间(14.00±0.40)h明显多于胰酶法(4.59±0.10)h(P<0.01)。

3 讨论

心血管疾病的相关研究一直是国内外学者关注的热点，培养原代心肌细胞加以各种创新技术的使用，如流式细胞仪，膜片钳，原子力显微镜等[7]来进行体外相关实验，使其更加快捷高效，且排除了内分泌调节的影响。相对于心肌细胞系(如H9c2)而言，原代心肌细胞能更有效地反映心脏的生理功能和基因表达[8]，故保证其结构和功能完整进而建立理想的体外细胞模型对心血管疾病的相关研究至关重要。

在心肌细胞原代培养过程中，选择出生1～3 d的乳鼠进行实验，出生时间越短，乳鼠心脏组织间的胶原组织含量越少，越易于消化且节省时间。消化心脏组织过程中，酶的选择是关键因素，胰酶具有很强的消化能力，对心肌细胞造成的损伤较大[9]，消化时间长导致心肌细胞结构受损，粘附效果不佳，活性降低[10]。故在使用胰酶法消化时需要根据心肌组织含量的多少严格把握好消化的力度和时间，否则容易出现细胞消化过度。而Ⅱ型胶原酶消化能力温和，在消化胶原组织的同时，将心肌组织分解成单个细胞，对心肌细胞损伤小，且消化得到的心肌细胞存活率显著提高，可以保证良好的细胞活性。故胰酶+Ⅱ型胶原酶法优于胰酶法。

消化得到的细胞悬液中含有大量成纤维细胞，由于成纤维细胞分裂增殖的能力很强，利用成纤维细胞先于心肌细胞贴壁来对心肌细胞进行纯化，本实验在传统差速贴壁[11](差速贴壁一次，共90 min)的基础上，再进行第二次90 min的差速贴壁，保证了心肌细胞的高纯度。

在本实验过程中，我们从取心到获得可接种的心肌细胞这段时间内，与胰酶法相比，使用胰酶+Ⅱ型胶原酶法在取心后需要0.125%胰酶4 ℃过夜消化，故其实验所消耗的时间较长。而在消化过程中，胰酶法的消化程度较强，吸管吹打时用力不均匀，很容易对细胞造成负面影响，操作难度增加；Ⅱ型胶原酶作用温和，长时间消化对细胞损伤不大，故胰酶+Ⅱ型胶原酶法比胰酶法更易于操作，更加高效且获得的心肌细胞存活率更高，保证了心肌细胞结构和功能完整性。

综上所述，本实验证实了胰酶+Ⅱ型胶原酶法在两次差速贴壁下可以高效地提取出高存活率和高纯度的心肌细胞，但实验所消耗的时间较长，可在不损伤细胞的范围内适度增加酶的浓度来缩短消化时间，未来很可能成为基于原代乳鼠心肌细胞研究的常用方法。