车建美，刘国红，陈倩倩，刘 波

（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州350003）

0 引言

【研究意义】龙眼焦腐病菌[Lasiodiplodiatheobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]是龙眼采后病害的主要病原菌之一，采前以潜伏状态存在，果实采收后，遇到合适的温度和湿度，其菌丝穿透龙眼内果皮，侵染果肉，破坏果肉细胞组织结构，引起龙眼果实大量腐烂[1]，从而缩短龙眼果实的货架期，给龙眼的采后储运造成巨大的病害威胁[2]。因此，探寻安全有效的龙眼焦腐病菌生物防治技术，可为解决龙眼采后储运问题奠定基础。【前人研究进展】短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）可形成抗逆性强的芽孢，具有很强的环境适应力，这些优点为其应用提供便利[3−5]。短短芽胞杆菌应用广泛，主要包括生物防治[6]、水质净化[7]和表达载体[8]等。从美国黄石国家公园土样分离到一株短短芽胞杆菌菌株S1039，其产生的抑菌物质粗提物具有良好的抑菌活性，并且耐高温、耐碱性物质，对胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，能够抑制革兰氏阴性菌及阳性菌的生长[9]。从紫花苜蓿根际土中分离出的短短芽孢杆菌CY-42，其发酵液可以导致尖孢镰刀菌菌丝及孢子生长异常，出现菌丝扭曲、断裂、破碎，孢子数量明显减少等现象，对由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相对防效为64.03%[10]。【本研究切入点】短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX为本实验室分离得到的一株生防菌株[11−12]，该菌株对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和不同的真菌均具有较好的抑制效果[12]，对枇杷、龙眼等果实具有较好的保鲜效果[13−14]。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX可以抑制龙眼采后腐生细菌和真菌的生长，处理后的龙眼好果率明显高于对照处理，并且可以减少脱粒率[13]。然而关于短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼焦腐病菌生物防治有待深入研究。【拟解决的关键问题】分析短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼焦腐病菌的生长和形态的影响，并研究其发酵液的生防效果及对龙眼果实防御酶活性的影响，以期为短短芽胞杆菌在龙眼焦腐病菌的采后生物防治应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）FJAT-0809-GLX和龙眼焦腐病菌[Lasiodiplodia theobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]FJAT-3586由本实验室分离并保存。细菌培养采用NA培养基。龙眼焦腐病菌FJAT-3586培养采用PDA培养基。

1.2 离体条件下对龙眼焦腐病菌生长的影响

1.2.1 发酵上清液和菌体对龙眼焦腐病菌生长的影响挑取短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX单菌落于NA液体培养基中，30℃、180 r·min−1培养12 h后，按1%接种量接入NA液体培养基中，30℃、180 r·m in−1培养48 h后，13 000 r·m in−1离心2m in，取上清液备用。采用无菌水将菌体含量调至1×106个·m L−1。龙眼焦腐病病原菌FJAT-3586于PDA培养基培养5 d，取5 m L无菌水轻轻冲洗病原菌，制备病原菌孢子悬浮液（1×106个·m L−1）。取2m L龙眼焦腐病菌孢子悬浮液与20 m L PDA培养基混匀涂板，待其凝固后，采用打孔器打孔，孔径为6mm，分别向不同孔中加入50μL拮抗菌菌体、发酵上清液和无菌水，30℃培养48 h后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。试验重复3次。

1.2.2 不同培养时间发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的影响分别取培养2、8、16、24、32、48、72 h的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液，13 000 r·m in−1离心2m in，取上清液进行抑菌圈测定，测定方法同上，试验重复3次。

1.2.3 不同添加量发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的影响分别添加1、5、10、20、50 m L的短短芽胞杆 菌FJAT-0809-GLX发 酵 上 清 液于200 m L PDA培养基中，制备平板，取6mm龙眼焦腐病菌菌饼于该平板上，以等量的无菌水为对照，28℃培养3 d，测定菌饼直径并计算抑菌率。试验重复3次。

式中，Φ对照为对照处理的菌落直径，Φ处理为不同处理的菌落直径，Φ菌饼为菌饼直径。

1.2.4 对龙眼焦腐病菌菌丝形态影响的观察将活化的龙眼焦腐病菌FJAT-3586在PDA培养基上培养5 d，取6 mm菌饼置于PDA平板中央，在距离菌饼3 cm左右划线短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX，并以无菌水作为对照，30℃培养4 d。挑取少量靠近短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX处理的菌丝于载玻片上，滴加少量无菌水，盖上盖玻片，置于倒置显微镜观察。

1.3 离体果实接种的防治效果

将短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液用NB培养液稀释20倍，备用；焦腐病菌FJAT-3586孢子液用无菌水稀释至1×106个·m L−1。用蘸有75%酒精的酒精棉轻轻擦拭龙眼表面，晾干。将龙眼果实用短短芽胞杆菌发酵上清液浸泡30 s，晾干后再采用病原菌浸泡30 s。对照采用无菌水浸泡30 s，再采用病原菌浸泡30 s。每个处理30个，室温放置3 d，统计龙眼果实的好果数量，计算好果率[好果率/%=（好果数量/全部数量）×100]。试验重复3次。

1.4 对果皮防御酶活性的影响

取以上不同处理龙眼果皮组织1 g，加入10m L 0.05 mol·L−1磷酸缓冲液，研磨后于3 000 r·m in−1离心10 m in，取上清，用5 m L磷酸缓冲液提取沉淀2次，合并上清液定容至25m L作为粗酶液，4℃保存备用。参照王薇等[15]的方法进行SOD和CAT活性测定。

1.5 数据处理

采用M icrosoft Excel2010和SPSS 17.0进行数据统计分析，Duncan's法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 离体条件下对龙眼焦腐病菌生长的影响

2.1.1 发酵上清液和菌体对龙眼焦腐病菌生长的影响短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液和菌体对龙眼焦腐病菌生长影响不同。如图1所示，发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长具有明显的抑制作用，抑菌圈直径为15.77mm；菌体具有微弱的抑制效果，抑菌圈直径为3.84 mm；对照无菌水则无抑菌效果。

图1 发酵上清液和菌体对龙眼焦腐病菌的抑菌圈Fig.1 L. theobrom ae inhibition zone shown on m edium by ferm entation supernatant or bacteria cells

2.1.2 不同培养时间发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的影响将不同培养时间的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液进行抑菌测定，结果表明，随着培养时间的延长，发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的抑制作用逐渐增强（图2）。培养2 h和8 h的发酵上清液对龙眼焦腐病菌的生长无抑制作用，培养16 h、48 h和72 h的抑菌圈直径逐渐增大，分别为9.34、13.18、14.93 mm。

图2 不同培养时间发酵上清液对龙眼焦腐病菌的抑菌圈Fig. 2 L. theobromae inhibition zonesonmedium treated w ith supernatantsof varied fermentation time

2.1.3 不同添加量发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的影响培养基中添加不同量短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长的影响有所不同（图3）。添加1 m L的发酵上清液对该病原菌的生长无抑制作用。随着添加量的增多，抑制效果逐渐增强。添加5m L和10m L发酵上清液的抑菌率分别为28.30%和59.54%，添加50m L时，抑菌率可达74.17%。

图3 不同添加量上清液对龙眼焦腐病菌生长的抑制效果Fig.3 Inhibition of fermentation supernatant in varied dosages on grow th of L. theobromae

2.1.4 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼焦腐病菌菌丝形态的影响短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼焦腐病菌菌丝生长形态具有一定的影响。对照组菌丝细长，顶端无膨大，分叉少；处理组菌丝较粗，颜色较对照组略微加深，顶端膨大明显（图4）。

图4 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX对龙眼焦腐病菌菌丝形态的影响Fig.4 L. theobromae m ycelial grow th on medium w ith B. brevis FJAT-0809-GLX

2.2 离体果实接种的防治效果

不同处理后龙眼果实好果率有所不同。将龙眼果实用发酵上清液浸泡后，再采用病原菌浸泡，其好果率为68.33%，明显高于采用病原菌浸泡龙眼果实的好果率（图5）。果实的外观也明显不同，病原菌浸泡后，果实表面会长出病原菌菌丝，随后果实出现水渍，直至全部腐烂。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX处理后的果实表面菌丝生长较少，腐烂果实数量也较少。

图5 不同处理龙眼果实好果率Fig. 5 Ratesof healthy longan fruit under various treatments

2.3 对果皮防御酶活性的影响

不同处理龙眼果皮防御酶SOD和CAT活性有所不同（图6）。病原菌处理的龙眼果皮SOD和CAT活性分别为71.09、31.65 U·g−1·min−1。生防菌处理后再用病原菌处理，果皮SOD和CAT活性均升高，显著高于病原菌处理的SOD和CAT活性（P＜0.05），分别为139.43、54.54U·g−1·min−1。

图6 不同处理对龙眼果皮SOD和CAT酶活性的影响Fig.6 Effect of various treatm ents on SOD and CAT activities in longan fruits

3 讨论与结论

短短芽胞杆菌对香蕉炭疽病[16]、草莓灰霉病[17]和莲雾黑腐病[18]等不同病害具有较好的抑制作用，近几年来越来越多地应用于植物病害的生物防治。付岗等[16]研究结果表明短短芽胞杆菌对香蕉炭疽病的防效为50.06%~65.74%。短短芽胞杆菌QGJ-6对番茄青枯病的生防效果达到82.4%[19]。本实验室筛选得到的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX处理后的龙眼果实好果率明显高于病原菌单独处理的好果率，可达68.33%，说明其对龙眼焦腐病菌具有较好的抑制作用，从而扩大了短短芽胞杆菌在植物病害生物防治的应用范围。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液、菌体对龙眼焦腐病菌生长的抑制效果不同，发酵上清液对龙眼焦腐病菌生长具有明显的抑制作用，抑菌圈直径为15.77 mm。这与张平等[20]的研究结果类似，芽胞杆菌DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13无菌发酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌丝的生长，抑菌率最高可达81.14%。随着培养时间的延长和添加量的增多，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液抑菌效果也逐渐增强。贝莱斯芽胞杆菌SZAD1不同培养时间发酵液抑菌效果也不同，随着培养时间延长，其抑菌圈直径也逐渐增大，72 h上清液的抑菌圈直径为48 h的抑菌圈直径的3倍[21]。因此推测，随着培养时间的延长，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵上清液中抑菌活性物质的累积也逐渐增多。

前人研究表明，大多数生防芽胞杆菌对病原菌菌丝形态具有一定的影响[22,23]。本研究也发现短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX处理后的焦腐病菌菌丝较粗，颜色较对照组略微加深，菌丝体分叉明显增多、增长，顶端膨大明显。暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）LZ88对烟草褐斑病菌菌丝的形态也具有一定的影响，并且会抑制孢子的萌发[24]。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX可以抑制菌丝在果皮表面生长，病原菌处理的龙眼果实表面长满菌丝，而短短芽胞杆菌处理后果实表面菌丝则较少。

植物免疫抗性酶SOD、CAT、PPO等均参与了刺激植物细胞过敏反应和防御反应，当遭遇不良环境时，植物通过调节体内多种抗性酶的活性，降低逆境对其造成的伤害[25]。枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）SSR2I处理后，番茄根、茎和叶片的SOD活性明显提高[26]。本研究结果与之相似，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX处理后龙眼果实SOD和CAT活性均显著高于病原菌处理。李君等[27]也发现，芽胞杆菌B3处理后，在第5天，核桃叶片中CAT、POD、PPO、活性比对照分别升高了3.60、1.60、4.56倍。因而推测，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX可以作为微生物诱导抗性剂进行植物病害防治，后续研究中，将就该菌株对相关酶基因表达影响进行深入研究，为其在龙眼焦腐病生物防治提供一定的理论依据。