陈满静，曹绍书，谭金玉，阮仁超，李青风，高 杰，彭 秋，郑常祥，邓小锋*

（1.贵州省农业科学院旱粮研究所，贵州 贵阳550006；2.贵州省农业科学院农作物品种资源研究所，贵州 贵阳550006；3.贵州省农业科学院园艺所，贵州 贵阳550006）

0 引言

【研究意义】高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]是继玉米、小麦、水稻和大麦之后的世界第五大旱生作物，具有多种用途，可作为食品、饲料和酿酒的原料[1]。高粱炭疽病是发生在高粱生产中最为严重的病害，由于高粱炭疽病菌病原体种群在遗传上高度多样化，因此开展高粱种质资源炭疽病抗性鉴定，可为选育高粱抗炭疽病品种稳定抗病，同时为抗病基因的进一步研究奠定基础。【前人研究进展】高粱炭疽病最早发现于西非，是由禾生炭疽菌（Colletotrichum sublineoiumP.Henn.，Kabát and Bubák）侵染所致，该病菌属于无性态真菌炭疽病属[2]。近年来，该病害在中国大部分高粱种植区域均有发现，特别是在四川、云南、贵州、甘肃等地区，是造成我国高粱生产较重大经济损失的病害之一[3−4]。该病害严重降低籽粒品质及产量，导致感病品种减产36%的籽粒产量及67%的生物产量，在中国北方减产甚至达78%[5−6]。禾生炭疽菌可侵染高粱的所有地上部分组织，叶片侵染部位症状尤为明显。典型病症是叶片出现红褐色（或紫色）细小病斑，逐渐发展为椭圆形或者细长的褐色斑点，病斑中间出现黑色的分生孢子盘。随着病情发展，叶片组织逐渐死亡形成坏疽并连成片，因无法进行光合作用及营养物质缺失，植株最终枯萎死亡。许多研究结果显示高粱宿主防御炭疽菌侵染的机理包括侵染位点的细胞及邻近细胞合成3-脱氧花色素、H2O2、HRGP（Hydroxyproline-rich glycoproteins，富 羟 脯 氨酸糖蛋白）蛋白、黄酮类物质，细胞形成乳突、胼胝质沉积和蛋白质交联结构[7−12]。抗性材料的侵染位点细胞及邻近细胞释放囊泡内含物中的3-脱氧花色素，杀死炭疽菌的侵染囊泡和宿主细胞本身，阻止其向周围细胞侵染[9−10]，叶片上因此显示出红褐色或紫色的细小斑点。由于禾生炭疽菌种群具有丰富的遗传多样性[13]，因此筛选与鉴定稳定抗性的高粱遗传资源是抗病研究与育种的基础。印度国际半干旱热带作物研究所、美国农业部热带农业研究站及南方平原农业研究中心、德州农工大学（Texas A&M University）及中国辽宁省农业科学院植物保护研究所等机构使用各高粱遗传资源基础库，已经筛选和鉴定了一批适应各生态区域的高抗、稳抗的遗传资源[4,14−22]。【本研究切入点】贵州地方高粱资源具有穗密度合适、产量较高，适应西南地区栽种等特点，且资源相关研究也显示其中的糯高粱资源具有较丰富的wx基因型[23]。在贵州，广泛栽种的糯高粱主要作为酱香型白酒的酿造原料，2018年贵州全省共种植约8.67万hm2糯高粱，其中4万余 hm2是按照有机原料的标准进行生产[24]，需尽量避免农药的使用，因此有关贵州高粱抗性资源的筛选有待深入探讨。【拟解决的关键问题】本课题组于2011—2014年收集了一批贵州省的地方高粱资源，包括地方品种、农家种及野生高粱。本研究对其中283份贵州地方高粱资源进行为期两年的炭疽病抗性鉴定，得到一批新的高粱抗原材料，以期为后续研究和品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

283份高粱遗传资源材料从贵州省各地收集，包括地方品种和农家种。资源分布信息如表1所示。

表1 炭疽病抗性鉴定地方高粱材料Table 1 Sources of sorghum cultivars for anthracnose-resistance identification

1.2 试验设计

1.2.1 试验地设计 试验于2016年、2019年在贵州省黔南州惠水县好花红乡（26°0′39.29″N, 106°34′25.80″E）进行，该区域常年高温、雨水充沛，适合真菌病害试验。2015年在该试验地已经进行了少部分高粱资源的炭疽病抗性鉴定和产量测定[25]。本试验采用随机区组设计，小区长3 m，行间距0.5 m，每行约20个单株，每个材料种植一个小区并设3次重复。按照常规方法对试验地进行田间管理和施肥。

1.2.2 抗性鉴定2016年采用带病的秸秆碎片作为侵染源，播种前将粉碎后的秸秆混旋于泥土中，让种植的材料在田间自然感病；2019年除使用粉碎的带病秸秆作侵染源之外，待幼苗长至6片叶时，还将收集的感病叶子均匀放置在整个试验地的行间空地进行诱导发病。两年均在灌浆中期鉴定材料感炭疽病的程度和确定抗性等级，根据材料叶部感病程度记录等级数值，等级数值从1到7，根据Perumal和Burrell的方法[26,27]，略做改动，具体评价标准如表2所示。

表2高粱抗炭疽病害等级评价标准Table2 Evaluation criteria for grading sorghum anthracnoseresistance

1.2.3 等级数值的排列因为每个小区（重复）中所有的高粱单株感病程度都要观察与记录，因此许多小区内观察到的等级数值有多个。为了反映材料的主要抗性等级数值，数值按照以下方法排列：如果一个资源的等级数值至少出现在两个小区（重复）中，就排在抗性结果表的数值①列中，如果数值只出现在一个小区（重复）中，就排在数值②列中。如果资源有多个等级数值，数值的排序按照鉴定时该性状单株的大致数量由多到少的顺序进行。评估资源的抗性时，由数值①列中的鉴定数值进行评估。

2 结果与分析

2.1 两年田间发病情况

2016年、2019年试验地炭疽病害发病充分。灌浆的前中期病害发展处于最高峰，从叶片感病程度能完全分辨资源间的抗病性差异。在田间试验过程中，因有6份抽穗期极晚的高粱资源，其抗性可能是假阳性[28]，为不影响结果分析，其鉴定数值不列入结果中。通过统计分析剩余的277份高粱资源的感病状态，结果显示，多份资源在2019年的发病程度要大于2016年，说明诱导发病方法上，将粉碎秸秆和感病病叶作为接种剂的方法比只有粉碎秸秆的方法能带来更大的筛选压力。

2.2 高粱资源的抗性等级

抗性鉴定结果显示，2份高粱资源B39-2、F41两年的抗性等级数值均为2，叶片有3′-脱氧花色素抗性反应形成的细小紫斑（B39-2）或红斑（F41），但无分生孢子盘形成，表现为高度抗炭疽病。7份材料（表3中标记α）C22、C34、D1、F2、F10、F4、F15有分生孢子盘形成，但坏疽叶片面积较小，根据抗性等级标准，在2016年试验的等级数值为3或者4，F15等级数值为5，表现为中抗。筛选出的这9份抗性材料具体等级数值如表3所示。

7份中抗材料在2019年试验中有部分单株等级数值范围从4到5-1，表现为中抗；有部分单株等级数值范围从5-2到7，表现为感病，而且感病单株数要多于中抗单株数。分析此结果的原因有：⑴这些资源含有异质基因型；⑵试验地小区间病害压力并不均匀，在病害压力特别大的区域超过资源承受能力后，表现为感病。⑶试验地炭疽菌有不同生理小种，产生了不同程度的侵染现象。

鉴定结果显示两份材料E36、F4在2016年和2019年的抗性鉴定中等级数值存在极端等级的现象，反映出两份资源含有异质基因型，其中的部分材料对炭疽病有较高抗性，具体鉴定结果如表4所示。277份高粱资源中剩余的266份均为感病材料，占所有鉴定资源的96%，其中有148份高粱资源在两年的等级数值均为7，炭疽病害侵染程度特重，表现为高度感病。

表4 E36、F4抗性鉴定等级数值Tab le 4 Data on E36 and F4 graded for anthracnose-resistance

2.3 资源的其他特征

15份代表性高粱资源（表5中标记β）在2016抗性鉴定中表现为中抗，但在2019年鉴定中表现为高度感病。说明这些资源在较低病害环境中有一定抗病能力，但在高强度的病害压力下会完全丧失抗病性。此外，结果分析中发现共有十几份高粱资源，在2019年鉴定试验里有多于2个的等级数值，说明这些资源含有异质基因型。

表5 15份地方高粱资源的2016、2019年抗性鉴定等级数值Tab le 5 Data on grading 15 sorghum specimens for anthracnose-resistance in 2016 and 2019

3 讨论

3.1 试验与分析方法的有效性

在开展炭疽病抗性资源鉴定研究中，大部分研究使用的侵染源是带菌的种子或者孢子悬浮液，该方法的优点是炭疽菌有明确的生理小种，前期试验条件均匀，但同时也需要在田间病害充分发展后进行鉴定与评估。在本次鉴定试验中，2016年使用粉碎的秸秆作为侵染源，2019年同时使用粉碎的秸秆和保留于室内的感病病叶作为侵染源，进行田间发病后，依据资源的感病程度评估其对炭疽病的抗性。试验结果显示2019年的方法比2016年的方法带来更大的病害压力和选择力度，该方法对高抗资源的选择非常有利。经过两年鉴定，2个高抗资源表现出了稳定的抗性。同时其他田间试验也表明，鉴定的材料中如果没有较大比例的高感材料随机分布，只有抗性材料和部分抗性材料的存在，2019年采用的侵染源方法就不能发挥作用。

本研究中2016年采用的侵染源方法也有其科学意义，该方法能完全鉴定出高感资源。但该方法无法单独区分结果中的中抗资源（标识为α类）与β类资源。结果分析中利用了两年的比较结果，分析不同筛选环境下的等级数值，才鉴定出了α类与β类不同类别的资源类型。两类资源对炭疽病都具有一定的抗性，但两类资源都受病害强度的影响，中抗资源抗性的稳定性要大于后者。

研究中采用至少出现在两个重复中的等级数值作为该资源每年的抗性评估依据，同时在结果表中也保留了只出现在一个重复中的等级数值。通过对后者的观察与分析，推测这些数值的出现是由于以下原因：⑴试验地病害压力有小区域的差异导致侵染程度不同而形成的试验误差，⑵这些资源有异质基因型，⑶试验地有不同生理小种，⑷种子污染。比较两年的试验结果，发现2019年数值②列中的数量明显少于2016年，说明2019年的田间诱导方法所产生的更大鉴选压力能减少试验误差。但同时也可能掩盖部分资源有异质基因型的事实，特别是这些基因显现出微效数量性状的现象。

3.2 鉴定出的资源及后续研究

研究中鉴定的两份高抗资源B39-2、F41在田间的表现是叶片有细小紫斑或者坏死红褐色小点，没有含分生孢子盘的炭疽菌斑。田间试验中的炭疽菌群是混杂的，没有明确的生理小种区分。因此后续试验中需要收集和分离生理小种，对两份资源进一步鉴定，以提高抗性评估的准确性及评估其适应性。

在进一步研究的基础上，试验中鉴选出的7份中抗资源也可以用于后续的品种选育等工作中。一般情况下，成熟耕地中炭疽病害压力要远远小于研究中2016年试验的鉴选压力。由于中抗资源的抗性依赖于病害压力的大小，其抗性承受有一定的范围，因此对此类资源的后续研究需要重新设计试验方案并结合炭疽生理小种来进行。

从277份地方资源中发现至少十几份资源含有不同的等级数值，包括中抗资源类型、E36、F4等材料。特别是E36、F4材料，有着3、7和2、5-1这样极端分布的等级数值，说明这批资源中有一些确实含有杂合基因型，特别是收集的农家种材料。在对这批资源进行wx基因型分析时也发现了此特征[24]。后续工作中，需对该类资源进一步筛选和纯化。

3.3 使用中抗资源创制新抗性资源

两年鉴定试验表明贵州当地高粱材料中，对炭疽病的稳定抗性资源非常少。现有研究结果显示炭疽菌对宿主防御反应的抑制或宿主防御相关基因的无义突变导致高粱宿主抵御炭疽菌侵染的无效性[5,8,12,29−31]。推断这种抑 制是发生在宿主细 胞防御的信号转导阶段，而无义突变可发生在参与信号转导的基因与下游被调控的功能基因序列中。鉴定的高抗资源F41，推断其防御系统的上下游都能正常发挥功能；而鉴定的中抗资源，其防御系统的某部分受到了削弱。基于以上的推断，后续工作中可对本研究中已经鉴定的中抗资源进行相互杂交，如果资源间基因位点能够互补，可能从F2/F3分离群体中能鉴选出对炭疽病高抗的单株重组体，即新抗性资源。