罗亨宇 杨旌鸿 候垚顺 李志勇# 缪朝玉△

（海军军医大学，1 药理学教研室，2 基础医学院学员16队，3 基础医学院学员11队，上海 200433）

微管（microtubule）是真核细胞骨架的基本成分，是由alpha/beta微管蛋白（α/β-tubulin）二聚体组成的中空管状结构，该二聚体结构在进化上高度保守，在不同物种间高度相似。微管在细胞中发挥着多种关键功能，是决定细胞极性、细胞形态及细胞内转运的关键，它们既能形成有丝分裂和减数分裂的纺锤体，还可以聚集形成一些特殊的结构，如轴丝（纤毛和鞭毛的主干）、中心粒（中心体的核心结构）以及血小板的边缘带等。

结构保守的微管蛋白能承担细胞多种功能，主要原因是其结构和性质可受多种机制的调控。其中，微管蛋白翻译后修饰是一种重要的调控方式[1]，包括alpha微管蛋白的去酪氨酸化、40位赖氨酸的乙酰化、C端的谷氨酸化和甘氨酸化等，这些修饰可以选择性地调控微管的功能，主要机制包括直接控制微管的力学性质和稳定性以及调节与微管相关蛋白（MAPs）的相互作用，这些发现推动了“微管蛋白编码”观点的提出[2]。1994 年，在草履虫的微管蛋白中发现了多聚甘氨酸化修饰[3]，自此以后甘氨酸化修饰的研究方法日臻成熟，实验研究取得新的进展，特别是发现了负责调控甘氨酸化的酶，使人们对甘氨酸化的调控机制有了更深入的了解。此外，随着遗传修饰、显微镜方法等技术的发展[4]，甘氨酸化与疾病的联系也在逐步显现。现就微管蛋白甘氨酸化修饰的研究进行回顾梳理和展望。

1 微管蛋白甘氨酸化修饰

在哺乳动物中，微管蛋白甘氨酸化主要是由与谷氨酸化修饰酶同家族的微管蛋白酪氨酸连接酶类似酶系（tubulin tyrosin ligase-like，TTLL）催化[5]。甘氨酸化的起始分支和延伸由不同的酶催化：其起始分支，即第一个甘氨酸通过异肽键与微管蛋白C端的谷氨酸位点相连，由TTLL3[6]和TTLL8催化；延伸，即后续的甘氨酸通过与上一个甘氨酸残基的γ羧基形成肽键或异肽键逐个加入，由TTLL10催化[5]。人TTLL10中心结构的2个氨基酸突变导致其在人体没有活性[5]，目前这一改变仅在人类发现[7]。直接催化去甘氨酸化的酶至今还未被发现，尽管有研究表明胞质羧肽酶家族部分成员可能具有去甘氨酸化的功能[8]，但需要进一步实验来验证。

微管蛋白甘氨酸化的检测常通过特异性抗体进行。过去常用2种单克隆抗体，分别为TAP952和AXO49[9]，其中，TAP952专用于检测微管蛋白的单甘氨酸化[10]，而AXO49用于检测含3个及以上甘氨酸残基的微管蛋白多聚甘氨酸化。另一种多克隆抗体polyG也可检测4个或更多甘氨酸残基的微管蛋白多聚甘氨酸化[11-12]。以上抗体都只能检测运动纤毛的微管蛋白甘氨酸化[13]，而gly-pep1抗体可以检测初级纤毛中微管蛋白翻译后的甘氨酸化[14]。

2 微管蛋白甘氨酸化功能

2.1 微管蛋白甘氨酸化与微管稳定性的关系

微管甘氨酸化可以通过调控纤毛的稳定性发挥生物学功能，这种翻译后修饰调控微管稳定性的机制，是通过改变微管蛋白C端的空间构像和理化性质，进而改变C端的旋转半径和结合结构，以此稳定微管与纤毛，从而维持纤毛正常功能。

事实上微管蛋白C端的空间构像和理化性质对于微管的功能和稳定具有重要的意义。微管蛋白二聚体由一个紧密折叠的“身体”和无序的带负电的C端构成[16]，C端的变化可在不干扰微管二聚体之间的聚合界面的情况下，调整微管的生物物理特性及其与细胞效应器的相互作用[17]。C端的柔韧性和大回转半径有可能增加与其他分子在各种方向上发生接触的概率，从而增加关联率[18]。微管通过改变微管蛋白二聚体C端，表现出的“动态不稳定性”，赋予它们生长和收缩的特性[15]，令微管在细胞分裂、分化和运动等过程中发挥功能。

而微管蛋白翻译后的甘氨酸化修饰就发生在C端的尾部，具有稳定微管的作用。甘氨酸化通过稳定微管来参与控制纤毛长度的现象，在运动纤毛的轴丝[6，9]、精子鞭毛[5]和光感受器的连接纤毛[19]中都曾被发现。微管的甘氨酸化水平通过下列机制引起纤毛长度的改变[14]：甘氨酸是中性氨基酸，可使微管蛋白的净负电荷保持稳定，减少带正电的MAPs与微管的相互作用，下调带正电的微管相关蛋白spastin等对微管的切割，增加微管稳定性，维持纤毛长度。

2.2 微管蛋白甘氨酸化与谷氨酸化的关系

微管蛋白甘氨酸化对谷氨酸化具有抑制作用，抑制作用的主要机制是它与谷氨酸化修饰的位点相同，可以通过与谷氨酸化竞争相同的修饰位点抑制谷氨酸化。

谷氨酸化主要作用是增加微管蛋白局部净负电荷，促进C端与马达蛋白和MAPs相互反应。因此谷氨酸化是介导微管分离的关键调节因素，它通过为C端增加净负电荷的方式调节带正电荷的微管相关蛋白spastin切断微管，具体作用取决于微管蛋白二聚体中谷氨酸化修饰添加的谷氨酸的数量：未超过8个谷氨酸时，它会增强spastin的活性，降解微管；反之，会对spastin发挥抑制作用[21]。有研究显示中心体微管蛋白高度谷氨酸化，且spastin和katanin含量较高[22]，因此这种机制可能在中心体起关键作用。

3 微管蛋白甘氨酸化与疾病

在人体中，纤毛异常可导致广泛的病理学改变，通常称为纤毛病[23]。微管蛋白翻译后修饰在维持纤毛结构和功能中具有重要作用[24]。由于甘氨酸化[25]对微管与纤毛结构具有重要调节作用，其缺乏也是纤毛病的危险因素之一。微管甘氨酸化在小鼠实验中显示有利于运动纤毛的完整性[7]和初级纤毛长度的控制[14]，在人类细胞中可能亦有类似作用。

3.1 微管蛋白甘氨酸化与中枢神经退行性变

在中枢神经中，微管多聚谷氨酸化水平异常增高，可导致神经退行性改变。甘氨酸化通过竞争性抑制微管蛋白的谷氨酸化，使得多聚谷氨酸化反应过度积聚的情况得以缓解或避免，进而在中枢神经的退行性改变中起到保护作用[27]。

去甲酰化酶CCP1的基因突变可导致小鼠Purkinje细胞退行性变（pcd）[26]，这种小鼠的微管蛋白多聚谷氨酸化过度积聚，特别是在神经系统发生变性的区域[27]。其机制可能是通过调节微管切断酶spastin的活性影响微管稳定[28]。甘氨酸化由于可以通过减少谷氨酸化为微管C端增加的净负电荷，进而下调微管切断酶spastin的活性，从而起到保护作用。此外，多聚谷氨酸化可以通过促进微管相关蛋白与微管的结合降低微管的稳定性[28-29]，但目前关于神经元内多聚谷氨酸化的分子机制尚不明确，与之相关的甘氨酸化的分子机制也尚待阐明。

3.2 微管蛋白甘氨酸化与视网膜退行性变

在视网膜中，甘氨酸化酶TTLL3的缺失会导致视网膜微管蛋白甘氨酸化的缺失，使得连接纤毛数量下降，感光细胞谷氨酸化水平升高，连接纤毛中谷氨酸化-甘氨酸化失衡，进而导致视网膜退行性改变。

光感受器中微管的谷氨酸化首先发生在基底体内，而后伴随着连接纤毛的组装完成，而甘氨酸化随着连接纤毛的组装而逐渐产生，并且在感光细胞2外节快速生长后完成[19]。甘氨酸化酶TTLL3基因敲除小鼠模型显示，甘氨酸化水平下降而谷氨酸化水平升高，光感受器进行性退化，这与人类的视网膜缓慢退化的过程类似[30]。另有研究表明，甘氨酸酶TTLL3基因的突变足以诱导感光细胞缓慢退化，连接纤毛缩短[31]，Müller胶质细胞大量活化，视网膜应激[32-33]以及光感受器细胞凋亡增加。

视网膜中的甘氨酸化与谷氨酸化相互抑制。这在pcd小鼠模型发生的视网膜变性中得以发现[34]：pcd小鼠的甘氨酸化酶TTLL3水平正常，但其感光细胞中的高谷氨酸化也会减少甘氨酸化，进而导致视网膜变性。关于两者平衡影响视网膜的具体机制，多个研究认为可能与连接纤毛中的鞭毛内转运部分功能障碍有关[34-38]，而这其中的酶机制还有待进一步研究。

3.3 微管蛋白甘氨酸化与结直肠癌

在结直肠癌的发生发展过程中，TTLL3减少导致的结直肠上皮组织中微管蛋白甘氨酸化缺乏，会减少初级纤毛的数量，降低初级纤毛对Wnt信号通路的抑制作用，增加结肠上皮细胞的增殖，从而增加结直肠癌的发病风险。

TTLL3是结肠中催化微管甘氨酸化的唯一酶，也是结直肠癌发生发展中重要的调节因素[39]。有实验显示原发性结直肠癌和其转移瘤中TTLL3的表达显著下调，而良性结直肠肿瘤中TTLL3的表达水平与正常结肠组织相似。这个结果表明，人类结直肠癌的发生发展与TTLL3表达水平下调有关[40]。具体原因在于，TTLL3的下调、丢失或失活会导致结肠细胞微管甘氨酸化的降低或缺失，并直接导致初级纤毛的减少或丢失；而初级纤毛的数量与结直肠癌的发生发展有直接关联：初级纤毛对Wnt信号的传递具有抑制作用，其数量的减少可以促进Wnt信号的传递[40]，Wnt信号越强则结肠上皮细胞的增殖能力越强，结肠癌易感性越高[41-42]。

随着微管蛋白甘氨酸化在结直肠癌中作用的发现与证实，以及机制的逐渐阐明，提出了微管蛋白甘氨酸化、初级纤毛相关的新治疗策略。有研究显示将肿瘤细胞中初级纤毛的恢复作为一种治疗策略[43]，这种策略是未来关于微管蛋白甘氨酸化研究的方向之一，其临床应用还需要进一步探索。此外，甘氨酸化酶TTLL3也是结直肠癌治疗的潜在靶点之一。

3.4 微管蛋白甘氨酸化与精子运动障碍

在精子中，微管蛋白甘氨酸化水平的降低，可导致精子轴丝内动力蛋白臂的构象异常，使得精子的鞭毛摆动活动异常，精子无法直线游动，进而可导致雄性生育力下降。微管蛋白甘氨酸化修饰对保持精子的正常结构和功能是必需的。

最近的一项研究表明[44]，在微管蛋白甘氨酸化2种关键酶TTLL3和TTLL8均被敲除的小鼠中，微管蛋白甘氨酸化完全消失。尽管这种小鼠没有重大缺陷，呼吸道等部位的运动纤毛以及精子的鞭毛依然存在，但随后发现雄鼠生育力下降，且精子主要沿环形路线游动，无法正常直线游动。采用计算机辅助精子分析，显示原因主要在于精子鞭毛运动的紊乱。利用低温电子断层扫描进一步探究机制，显示微管蛋白甘氨酸化缺失导致精子鞭毛的外运动蛋白臂（outer dynein arm，ODA）和内运动蛋白臂（inner dynein arm，IDA）超微结构受到扰乱。ODA和IDA是精子轴向动力蛋白，是鞭毛运动的必要结构，其中ODA主要控制鞭毛摆动的幅度和频率，而IDA控制波形[45]。ODA和IDA超微结构的扰乱导致鞭毛摆动的幅度减小，而频率增加，波形也发生扭曲，进而导致了精子活动的异常。

事实上人类的精子数量相对于小鼠往往更少[46]，而直线游动又是精子在女性生殖道中到达卵母细胞的关键条件，因此微管蛋白甘氨酸化的缺乏可能导致男性的不育。这一发现表明微管蛋白甘氨酸化对维持正常精子运动功能至关重要，也为后续针对男性不育的研究提供了新的角度。

3.5 微管蛋白甘氨酸化与其他疾病

目前的研究表明，微管蛋白甘氨酸化可能与其他疾病有潜在的关联。例如最近的一项研究表明[47]，微管蛋白甘氨酸化在运动纤毛中可以增强基底体对细胞的附着，从而促进运动纤毛的规律摆动，这可以增强呼吸道对粘液的清除，因此微管蛋白甘氨酸化的缺乏可能与呼吸道疾病的发生相关。

尽管目前关于微管蛋白甘氨酸化的研究还主要集中于运动纤毛中的甘氨酸化，但随着gly-pep1抗体被发现可以用来检测初级纤毛存在的翻译后甘氨酸化修饰[21]，未来会逐渐深入关于初级纤毛中甘氨酸化的研究。因此，在其他富含微管以及微管蛋白翻译后修饰的组织或生命活动中，如血小板、肌细胞、细胞有丝分裂等[48-51]，关于微管蛋白甘氨酸化的功能及其调控机制将被进一步阐明。

目前，对于微管蛋白甘氨酸化的酶、体内相关功能有了较为详细的研究，而其在体内作用的具体机制也随着免疫标记等技术的发展逐步得以阐明，研究也表明了这种翻译后修饰与一些疾病的关联。但是，对于微管蛋白去甘氨酸化的酶至今没有得到证实，因此微管蛋白甘氨酸化水平的调控机制仍有待进一步研究[52-53]。这种修饰与疾病的关联为相关研究提供了新的方向，关联的具体机制可以通过进一步的研究加以证实，这些关联机制中的特殊结构可以作为新的靶点，用来研发治疗相关疾病的新方法新策略，例如，初级纤毛有望成为癌症治疗新靶点[39]。此外，微管蛋白甘氨酸化因其明确的酶和重要的功能，也可能作为关联疾病检测标志物，得以转化为临床应用。在转化过程中，多学科交叉的、精确结构的研究和分析不可或缺，这也为以后的研究提出了新的挑战。