张玉姣，宋金鹏，郭学民，彭新辉，孔 波，杨华武，马景浩，范光森*

（1.北京工商大学 食品与健康学院，北京 100048；2.德州市纤维检验所，山东 德州 253000；3.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，湖南 长沙 410014）

烟草（Nicotiana tabacumL.）是管状花科目，茄科，一年生或有限多年生的草本植物[1]。我国烟草种植面积广，但因多种因素影响，部分烟草在品质上存在着一定的缺陷，如在香气方面表现为量少且质差、杂气较多、刺激性较大；在吃味方面表现为粗糙、苦、辣、涩及滞舌等[2]。为了改善烟草品质，卷烟工业企业常采用多种措施，如进行打叶复烤、醇化及其他特殊处理等[3]。在众多措施中，醇化是改善烟草品质的有效手段。醇化是将复烤后的烟叶，在条件良好的仓库内长时间（1～2年）贮存，借助烟叶中原有或环境微生物作用进行缓慢的生物和化学反应，从而达到提高烟叶品质的一种温和的提质方法，在此过程中，微生物的代谢活动对改善烟草品质发挥了重要的作用。随着科研工作者对醇化处理烟叶研究的深入，微生物在烟草行业中的应用日益得到重视，期望通过对微生物功能的挖掘，解决醇化中的一些不足，实现烟草品质的更好提升，并且微生物在烟叶减害降焦及处理烟草废弃物等方面也具有重要作用。本文从微生物视角对烟叶中微生物菌群结构变化、微生物降解烟叶中有害物质、促进增香及在烟草废弃物中的应用等进行概述，为微生物在烟叶中的综合使用提供参考。

1 烟叶醇化中微生物菌群组成及其演替规律

在烟叶生长、贮存及其他加工过程中，存在种类繁多的微生物，这些微生物在烟叶醇化过程中起到重要的作用，因此，探索烟叶醇化过程中微生物菌群种类及其变化规律十分重要。

1.1 烟叶醇化中微生物菌群组成

早在20世纪中期，就有相关学者开展了烟草醇化过程中烟叶表面微生物研究，结果发现在烟叶醇化过程中有不同种类的微生物参与。随着我国相关研究的发展，烟叶醇化中的微生物种类也得到研究者的关注和重视。如赵铭钦等[4]研究表明，细菌是醇化期间烤烟叶面中的优势菌群，其种类和含量最多，而放线菌和霉菌则相对较少，并且细菌以芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属，放线菌和霉菌的优势菌属则分别是链霉菌属（Streptomyces）和曲霉属（Aspergillus）。杨金奎等[5]分离醇化烟叶表面中的微生物，结果表明烟叶表面微生物主要为细菌和真菌，未分离到放线菌和酵母菌，这与早期的研究结果一致。相关研究还发现，在醇化烟叶的高温微生物中，细菌同样占绝对优势，主要包括芽孢杆菌属和地芽孢杆菌属（Geobacillus），其中芽孢杆菌属为优势细菌属；霉菌则相对较少，主要为青霉属（Penicillium）和曲霉属，同样，也未分离到放线菌和酵母菌[6]。杜佳等[7]研究发现，醇化的茄衣叶片表面微生物中细菌占比达到99%，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是优势细菌菌群，除此之外，叶片表面含有痕量霉菌，而未发现酵母菌和放线菌。

随着分子生物学和高通量测序技术的不断发展，采用分子生物技术有助于系统分析烟叶中微生物的多样性，如龚俊[8]利用高通量测序法和克隆文库法对醇化烟叶表面的微生物菌群及优势菌群进行分析发现，细菌的多样性和丰富度均高于真菌，且假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是细菌的优势属，而真菌的优势属是根霉属（Rhizopus）和散囊菌属（Eurotium）。苏加坤等[9]利用宏基因组测序技术对来自不同地区和不同部位的烟叶叶片中的微生物多样性进行了分析，结果也表明醇化烟叶中细菌多样性高于真菌多样性，且对醇化品质有积极影响的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和具有生物防治功能的假单胞菌属是细菌中的优势菌群，而曲霉属则是真菌中的优势菌群。

综上可见，无论是采用传统微生物筛选方法还是借助现代分子生物技术，大量研究结果都表明细菌是醇化烟叶中的主要微生物菌群，霉菌次之，而放线菌和酵母很少或不存在；另外，不同种类或不同醇化阶段、方式的烟叶中微生物种群存在差异，尤其是优势菌属或菌种差异明显，这可能与烟叶加工工艺、烟叶品种及醇化时间和环境等相关，这一差异也正是不同烟叶产品间风味迥异的原因之一。有关醇化烟叶中微生物菌株的组成分析有助于筛选获得功能微生物用于烟叶醇化中，从而解决当前醇化存在的一些不足。

1.2 烟叶醇化中微生物菌群演替规律

烟叶含有一定的糖、蛋白质和脂肪等有机物质，是微生物生长和繁殖的营养成分。在烟叶醇化中，微生物生命活动发挥了重要的作用，微生物通过分解和利用烟叶中的部分营养物质产生代谢物和生物酶，且生物酶会进一步降解和转化烟叶中成分产生相应酶作用产物，而这些微生物代谢物和酶作用产物之间也会发生部分化学反应，最终实现烟叶品质的改善[10-11]。伴随烟叶醇化的进程，烟叶中营养成分、微生物的代谢活动及所处环境会发生不断变化，从而引起烟叶中的微生物菌群时刻发生变化，也正是微生物的演替变化，促使了烟叶醇化的完成。由此可见，明晰烟叶醇化中微生物菌群的变化规律有助于更好的改善醇化对烟叶品质的提升效果。GIACOMO M D等[12]研究了烤烟烟叶表面微生物的动态变化规律，结果表明在烟叶醇化早期酵母菌占有一定优势，但随着时间的延长，乳酸杆菌属（Lactobacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）逐渐成为优势菌群，至后期，芽孢菌属和放线菌属（Actinomyces）成为优势菌群，这证实了醇化后烟叶中细菌为优势菌群而酵母很难被检测到的原因。浦绍占[13]通过分析不同仓储烟叶醇化中细菌和真菌多样性的变化发现，随着醇化时间的延长微生物种类和数量不断变化，在醇化初期细菌种类最多，随后其种类逐渐减少，真菌变化规律与细菌类似，也随着醇化时间的延长其种类呈现降低趋势，但在醇化过程中细菌和真菌的优势菌属未变，分别为芽孢杆菌和根霉属。白维晓等[14]研究了醇化烟叶表面的真菌种类及其动态变化，结果表明醇化烟叶中真菌数量的动态变化与环境条件有关。综上可见，烟叶醇化过程中微生物菌群发生着有规律的动态变化，对该变化规律的掌握有助于更好地调控烟叶醇化。另外，不同烟叶醇化过程中微生物菌群组成及其动态变化规律不甚一致，除因研究手段引起的差异外，更多的原因可能与烟叶中营养成分及其所处环境的差异有关。也正是烟叶中微生物菌群呈现的不同动态变化规律，导致了烟叶的不同品质，两者之间相辅相成。深入探究烟叶醇化过程中微生物的动态变化规律，尤其是烟叶中营养成分及环境温度、湿度与微生物变化之间的关联，有助于科学合理的通过人工干预烟叶醇化，进一步提升烟叶品质。

综上，烟叶醇化过程中存在众多微生物，这些微生物在醇化过程中呈现一定的变化规律。烟叶醇化过程中微生物的组成及其变化规律与烟叶种类及醇化所处环境有关。我国有关微生物在烟叶醇化中的研究尚处于起步阶段，且当前研究主要集中于自然发酵过程中微生物的种类及其动态变化，而有关这些微生物种群之间是如何相互作用形成特有的动态变化规律的，每种微生物的作用如何，如何利用这些微生物及其动态变化规律更好的调控微生物发挥其提高烟草品质的功能等问题都尚未解决，这些问题的解答将有助于通过特定功能微生物的强化高效地调控烟草醇化，为烟草品质改善提供理论指导。

2 微生物在烟叶产香方面的应用

2.1 微生物促进烟叶增香

有关微生物改善烟叶品质的研究始见于TAMAYO A I等[15]的报道，研究表明微生物可以增加烟叶香气成分，在所试微生物菌株中尤以芽孢杆菌和小球菌（Pediococcus）效果突出，能显著提升烟叶香气，改善烟叶吸食品质。吕欣等[16]利用从烟叶中分离的烟用增香微生物处理烟叶，不同微生物处理的烟叶理化指标发生了不同程度的变化，感官评吸结果表明增香微生物可以改善烟叶的烟气浓度、香气量和细腻感。郑坚强等[17]利用西方许旺酵母菌（Schwanniomyces occidentalis）液处理烟叶，对烟草香气有重大贡献的致香物质β-紫罗兰酮的含量增加了35.62%，二氢猕猴桃内酯增加了21.52%，感官评吸表明，发酵处理提高了烟叶的香气质和香气量，烟叶品质得到明显提升。贺兆伟等[18]利用疣孢青霉（Penicillium verruculosum）所产果胶酶处理烟丝，显著降低了烟丝中的果胶含量，增加了香气量，烟气浓郁饱满，明显提升了烟丝感官质量。余玉莎等[19]利用产香真菌米根霉（Rhizopus oryzae）处理烟叶，烟内18种致香成分的含量得到提高，吃味得到改善。胡志忠等[20]优化了产香酵母处理烟叶的条件，优化后石油醚提取物含量达到8.45%，其中新植二烯含量较未处理烟叶中含量增加了78.07 μg/g，在提升烟叶品质方面具有一定潜力。覃明娟等[21]利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）处理烟叶，烟叶中淀粉含量大幅度下降，水溶性总糖和还原糖含量明显提升，并且新增了9种挥发性香气物质，烟碱含量有所降低，显著提升了烟叶感官评价，改善了其吸食品质。陈笃建[22]利用烟叶中分离的产香酵母处理低次烟叶，降低了易带来刺激、余味不佳的醛类物质含量，提升了其吸食效果。综上可见，利用微生物处理烟叶可以将烟叶中的部分组成成分转化为香气物质，从总体上提高烟叶品质，改善吸食效果。但总体上，有关烟叶中微生物功能研究还相对薄弱，尤其是其产香特性及其内在机理。加强烟叶中微生物功能的挖掘，尤其是针对不同烟叶产品在品质提升方面的不同需求筛选对应功能微生物，然后利用这些微生物进行单一或组合处理烟叶，对提升烟叶的综合品质有重要的意义。

2.2 微生物处理烟梗促进品质改善

烟梗是烟叶的重要组成部分，其主要成分是细胞壁物质，含有大量的木质素、果胶以及纤维素，总糖和烟碱含量较低，糖碱比失调，导致抽吸时产生强烈的刺激性和杂气，涩口，香气量少[23-24]。因此，降解添加至卷烟中的梗丝木质素、果胶等影响卷烟吸味的成分是改善卷烟品质的有效途径。宁振兴等[25]研究了具有高效降解烟梗中果胶和纤维素的产香菌株塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）的发酵产香和产酶能力，结果表明，塔宾曲霉能有效降低烟梗中的果胶和纤维素含量，具有提高烟梗质量的潜力。宋自力等[26]研究了血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus）粗酶液和菌丝对烟梗的生物降解，结果表明，血红密孔菌及其产生的漆酶具有较强的木质素降解能力，具有发酵增香、改善烟梗品质的应用前景。宋丽丽等[27]研究了白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）发酵处理烟梗，结果发现，经白腐菌处理24 h，烟梗中木质素降解23.11%，总糖和葡萄糖含量分别增加10.84%和4.86%，还在一定程度上消除烟梗中蛋白质燃烧产生的不良气味，改善了烟梗燃烧时产生的木质气。由此可见，微生物可以通过其所产生的漆酶、果胶酶等生物酶降解烟梗中含量较高的木质素和果胶等成分及其他有害物质，并将其转化形成一系列有益小分子化合物或香气物质，如有机酸、苯甲醇、苯乙醇、萜烯类化合物等，从而有效提高烟梗利用价值，在烟草增香方面具有广阔的应用前景[28]。

2.3 微生物发酵再造烟叶促进品质改善

再造烟叶是将卷烟生产过程中产生的烟末、烟梗、碎烟片等废弃烟草物质进行重新组合加工制成的片状或丝状再生产品，主要用作卷烟填充料，在卷烟配方中占到8%～10%，起到降焦减害的作用。但再造烟叶存在香气量不足、杂气重的缺陷，限制了再造烟叶的应用[29-30]。为此，行业内普遍采用添加香精香料对杂气进行修饰，虽保障了香气量，但香气不协调，缺乏自然感，未能从根源上解决品质不佳的缺陷。微生物发酵是改善再造烟叶品质行之有效的措施，通过微生物分泌的各种酶系，可将再造烟叶原料中的成分转化为香味物质，减少杂气，提高香气成分，从内源上实现增香，从根本上解决再造烟叶的品质缺陷。郭刚[31]利用木质素降解菌P4和降烟碱杆菌B7处理烟草薄片生产的原料，烟草薄片品质得到了改善，尤其是双菌株共处理时效果更加突出，木质素和烟碱含量显著降低，刺激性明显减轻，口感更好，香气更浓，内在品质明显提高。唐自文等[32]利用微生物菌株A-511所产的果胶酶处理再造烟叶原料，降低了再造烟叶中的纤维素和果胶含量，使总糖和还原糖含量也有所减少，处理的烟草浆料柔软疏松，再造烟叶的可用性和致香成分的总量有所增加，再造烟叶的感官品质得到改善，杂气降低、刺激变小、香气明显改善、香气量显著提升。叶建斌等[33]利用类芽孢杆菌处理再造烟叶原料浸提液，使浸提液中蛋白质和还原糖含量降低，氨基酸含量提高，浸提液中香味物质种类和总量有所增加，再造烟叶的香气质和香气量明显增强，刺激性减弱，烟气更加细腻柔和圆润。黄申等[34]利用从再造烟叶浓缩液中分离出的产蛋白霉菌属（Planococcussp.）HS-1处理再造烟叶浓缩液，处理后的浓缩液中的中性香味成分总量提高了15.68%，且中性香味成分的种类有所增加，感官评吸表明，采用微生物处理后的再造烟叶制成的卷烟其香气质和香气量都得到提高。综上可见，利用微生物及其所产生的酶处理再造烟叶原料，可以从根源上提高再造烟叶品质，增加可用性。

3 微生物在降解有害物质方面的应用

卷烟烟气中存在几千种化学物质，是卷烟呈味的重要物质基础。然而，在这些众多化学物质中，也存在大量的有害成分，HOFFMANN D等[35]从这些化学物质中识别出44种烟气有害成分，包括焦油、烟碱、氨气、一氧化碳、苯并芘、甲基亚硝胺吡啶基丁酮、氢氰酸、苯酚及巴豆醛等危害性较大的物质。有效降低或降解这些有害成分（含量）是烟草科学研究的热点之一。降低卷烟烟气中的有害成分的方法和措施有很多种，但在众多方法中，微生物处理卷烟原料实现卷烟烟气中有害成分的降低效果突出，是行之有效的降害技术[36]。

3.1 降低烟碱含量改善品质

烟碱是烟草中的特征物质，一定浓度的烟碱含量能增加烟草制品的烟味，使吸食卷烟者产生一定的生理强度[37]，因此，烟草制品中有必要存在适量的烟碱。然而，烟碱含量过高会增加烟气的刺激性，影响烟草制品的吸味，更为重要的是会对人体健康造成伤害，故降低烟叶中的烟碱含量至合适浓度是生产烟草制品过程中必不可少的环节。现有技术如采用打孔稀释、滤嘴过滤等物理方法可降低烟叶中的烟碱含量，但这些技术也会造成烟草制品香气的损失，降低烟草制品的品质。利用能降解烟碱的微生物处理烟叶，不仅能实现烟碱含量的人为调控，而且还会在处理过程中产生一些香味物质，使烟叶品质得到提升[38]。CHEN C M等[39]利用烟草来源的菌株Nic22所制备的粗酶液处理烟碱含量高的上部烟叶，烟碱含量明显下降且烟叶刺激性降低，品质得到改善。MENG X J等[40]从烟叶中分离到一株可降解烟碱的米曲霉（Aspergillus oryzae），将其接种于含有烟草提取物的培养基中发酵40 h，烟草提取物中的烟碱降解量达到99.5%。任平等[41]利用微生物菌株Y523分别对上、中、下3个部位的烟叶进行处理，处理后烟叶中的烟碱含量均有不同程度的降低，尤其是上部烟叶，烟碱降解效果最为明显，达到28.7%，并且微生物处理后的烟叶糖碱比和氮碱比更加协调，品质得到改善和提高。翟贵发等[42]分离得到一株烟碱降解能力较强的假单胞菌（Pseudomonas），将该菌株处理质量浓度为2.0 g/L的烟碱溶液，烟碱降解率达到88.18%，当烟碱质量浓度为5.5 g/L时，其降解率为45.83%。由此可见，微生物中存在众多可以降解烟碱的菌株，在降低烟碱含量，提升烟草制品品质方面具有重要的应用价值。但目前相关研究主要集中于实验室，缺乏实际生产中的应用验证。加强降烟碱微生物功能的研究，有助于在实际生产中有目的地利用这些微生物处理烟叶，将烟叶中烟碱含量控制在合适范围，减少烟叶刺激性，同时利用微生物的转化作用生成香味物质，提升烟叶品质。

3.2 降低其他有害成分改善品质

烟气中焦油、氢氰酸、亚硝胺类、苯并芘和巴豆醛等有害物质的含量受烟叶中含有的淀粉、蛋白质、纤维素和果胶等大分子有机物含量的影响[43-44]。微生物处理烟叶可以降低烟叶中以上大分子有机物的含量，从而在一定程度上降低焦油、氢氰酸等有害成分的释放量，提高产品安全性。刘蓓[44]采用枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）或短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）混合发酵烟梗提取液，抑制了焦油中杂环化合物和多环芳烃的生成，同时降低了烟碱含量和其他有害成分的释放量。马林[43]采用微生物发酵和酶解处理低次等烟，烟叶中蛋白质降解了41.34%，烟气中有害气体氢氰酸、一氧化氮、一氧化碳和焦油生成量分别减少了76.2%、71.4%、42.3%和26.0%，显著降低了有害气体的释放量，减少了烟气刺激性。解民等[45]利用产香酵母处理烟丝，处理后烟丝总糖、还原糖、烟碱、焦油和一氧化碳含量降低。薛磊等[46]通过产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的功能微生物菌株进行组合处理醇化烟叶，降低了烟气中的氢氰酸、巴豆醛、氨气、苯酚和苯并芘含量，提高了产品安全性。宋鹏[47]从烟叶和卷烟中分离筛选获得了有效降解烟草中纤维素、蛋白质、果胶和淀粉等大分子物质的微生物菌株，并以合适的比例进行组合应用于烟叶处理中，培养24 h后，烟叶中纤维素、蛋白质、果胶和淀粉都有所降解，卷烟烟气中自由基、苯并芘等稠环芳烃以及烟叶特有亚硝胺等有害气体含量大幅度降低。田永峰等[48]利用解淀粉芽孢杆菌处理烟叶21 d后，亚硝酸盐含量降低了73%，减少了烟叶中亚硝胺的形成。汪安云等[49]利用白肋烟叶片中分离的内生细菌菌株根瘤土壤杆菌属（Agrobaterium tumefaciens）处理烟叶，亚硝胺含量降低了81.3%，推测可能是由于该菌株具有还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力。祝明亮等[50]同样从白肋烟中筛选获得了多种内生细菌，其中有6株具有较强的硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，应用于烟叶中能显著降低亚硝胺的含量。综上可见，微生物发酵烟叶制品是减害降焦的有效途径，可以从内在物质转化的思路上控制有害物质的含量及其生成，实现高效率、低成本地减害。

4 微生物在烟草废弃物中的应用

烟草废弃物是烟草加工生产过程中的副产物，含有较高的纤维素、半纤维素和木质素[51]，以及大量的天然化合物，是一种可再生资源。目前烟草废弃物通常采用直接倾倒在垃圾填埋场中等方式进行处理，对环境和人类健康造成了潜在的危害[52]。为了减少资源的浪费和降低烟草中有害成分对环境的污染，近些年越来越多的研究将焦点转移到烟草废弃物的再利用方面。基于烟草本身成分组成的特性，可以作为生物质碳源为微生物发酵提供能源，吉彦龙等[53]以废弃烟梗提取液为主要基质发酵生产富含类胡萝卜素的深红酵母（Rhodotorula rubra），这表明烟草废弃物在开发廉价微生物细胞蛋白领域具有潜在的应用价值。SU Y L等[54]研究发现，白腐菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和毛栓菌（Trametes hirsute）均能利用烟草秸秆分泌多种降解木质纤维素的酶，为微生物利用烟草废弃物生产酶制剂开辟了方向。张可可等[55]探究了干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵废弃烟梗提取液生产L-乳酸的条件，为有效利用烟草废弃物提供了可借鉴的思路。郑羽西[56]则利用米根霉发酵烟草废弃物高效制备L-乳酸，产量达到173.5 g/L，是目前同步糖化发酵产乳酸的最高水平。陈辰等[57]研究发现，可以利用烟梗废料发酵生产杀虫微生物白僵菌（Beauveria bassiana），开辟了烟草废弃物合理利用的新途径。DAI J Y等[58]利用提取茄醇和烟碱后的烟草废渣为原料，探究了枯草芽孢杆菌、粘液芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）和淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）固态共培养产微生物孢子的条件，结果表明烟草废渣是低成本高产孢子原料的新选择。SARBISHEI S等[59]采用氢氧化钠对烟草废弃物进行温和的预处理，然后利用微生物进行酶解和发酵生产生物乙醇，产量能达到理论产量的97%。由此可见，烟草废弃物是微生物天然的优质营养源，利用烟草废弃物可以转化制备多种多样的生物制品，这对综合利用烟叶废弃物有重要意义，为烟草废弃物的资源化综合利用奠定基础。

5 展望

随着对烟叶醇化过程中微生物组成及其动态变化规律认识的加深，微生物在烟草中的重要性得到越来越多的关注，未来，微生物在提升烟草品质中的应用将会越来越多。鉴于此，可以从以下几方面展开深入研究：（1）利用现代分子生物学技术系统剖析烟叶醇化中微生物种群及其变化规律，探究微生物种群及其变化与烟叶营养成分、环境因素以及香味物质形成和有害物质降解等方面的关联，挖掘提升烟叶品质的功能微生物；（2）采用传统筛选方法获得烟叶醇化过程中重要的功能微生物菌株，系统研究其生物学特性、产酶特性和产香特性，探究其在烟叶醇化过程中发挥作用的内在机理；（3）分析烟叶醇化过程中功能微生物之间的内在关系以及对其他微生物菌群的影响规律，通过发酵过程参数调控及其外源强化功能微生物的组合加速自然醇化过程，达到增香提质，提升烟叶品质的目的；（4）利用功能微生物或对应酶制剂处理烟叶，达到降焦减害，提高烟草制品的吸食安全性；（5）利用微生物降解烟草生长土壤环境中的有害物质含量（如农药与除草剂残留等），减少有害物质成分在烟叶中的富集，提高烟草制品的吸食安全性；（6）利用微生物处理烟草废弃物，实现环境保护的同时，制备人们所需的生物制品，提高烟草废弃物的附加值。总之，微生物在提升烟叶品质，提高抽吸安全性等方面的作用将会越来越突出，有待科研工作者继续深入探究，推动烟草技术的革新。