梁媛媛 涂 晔 安晓强 马 琳 江 键△

（海军军医大学，1 卫勤系数理教研室，3 药学院无机化学教研室，上海 200433；2 上海市东方医院药学部，上海 2001203；4 解放军总医院京西医疗区医技保障科，北京 100041）

皮肤瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是纤维增生性疾病，属于病理性瘢痕。机械刺激、遗传、全身和受伤部位局部感染等因素可导致皮肤伤口异常愈合，引起增生性瘢痕的生长甚至形成瘢痕疙瘩[1]。目前国内外治疗瘢痕多采用药物治疗、手术治疗和物理疗法。但由于个体差异，各种治疗方法的临床疗效有待观察，有的所需时间长、痛苦大、容易反复等[2-3]。因此，进一步了解病理性瘢痕的发生发展机制及寻找更为有效的治疗方法一直是研究重点[4-7]。已有研究表明，在增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的形成过程中，一个关键因素是伤口局部成纤维细胞过度增生和胶原等细胞外基质异常积聚[8]。现已证明，生物组织的行为是由电荷的流动所控制。驻极体作为一种方便易携的“永电体”，具有长期且相对稳定的带电特性，已有研究表明其可以影响细胞周期、血管通透性、药物透皮吸收速率等[9-12]。本研究建立在电生理学的基础上，将驻极体静电场应用于病理性瘢痕生长过程，探讨其对成纤维细胞生长和迁移的影响和可能机制，为病理性瘢痕的预防和治疗提供新途径和新思路。

1 材料和方法

1.1 驻极体的制备和分组

聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜，膜厚为13 μm （日本东丽株式会社）；驻极体的等效表面电位通过振动电容静电计（北京华晶科技有限公司）测量。驻极体制备方法参考文献[10]。实验分组如下：对照组为表面电位为0 的PP 膜，5 000 V 组为表面电位为5 000 V 驻极体，-5 000 V 组为表面电位为-5 000 V 驻极体。

1.2 实验动物和主要试剂

新西兰大白兔体质量（2～2.5）kg，购自海军军医大学实验动物中心[动物合格证：SCXK（沪）2018-0001]。

胰酶、胎牛血清、1640 培养基等购于Gibco 公司；PBS 缓冲液购于Servicebio 公司；CCK-8 试剂盒购于东仁化学科技（上海）有限公司；RNA 提取液购于武汉赛维尔生物科技有限公司；乌拉坦等常用试剂均购于中国医药集团化学试剂有限公司；荧光染料碘化丙啶（PI）等购于南京沃博生物公司。

1.3 兔耳瘢痕模型制备

碘伏消毒兔耳，20%乌拉坦（1 g/kg）耳缘静脉注射麻醉，每只兔耳腹侧用直径10 mm 打孔器造成圆形切口，完整切除全层皮肤，骨膜分离器剥离软骨膜，保留耳软骨，创伤间距大于1 cm。术后7 d 去除结痂，造成2 次创面。

1.4 瘢痕增生指数测量和成纤维细胞提取

兔耳创面形成后，自然愈合2 周。选取创面色红、质地硬、无毛发生长，高于周围正常皮肤的明显形成瘢痕的组织。然后按照分组分别外敷不同极性驻极体。每组随机分配1 只兔，驻极体每3 d 更换1 次。分别按实验目的随机取不同时间点的4～12 个瘢痕组织，将各组取下的瘢痕组织进行测量。

瘢痕成纤维细胞的提取方法按文献[13]进行。

1.5 细胞增殖活性检测

采用CCK-8 法检测瘢痕细胞增殖活性，通过检测活细胞线粒体脱氢酶的数量反映细胞增殖率。取对数生长的成纤维细胞接种于96 孔培养板中，将表面电位为0 V、-5 000 V 和5 000 V 驻极体分别作用成纤维细胞48 h 后，加入CCK-8 试剂10μL，继续培养1～4 h 后，振荡摇匀后用全自动酶标仪在450 nm 波长处测定各组细胞的吸光度值（OD 值，±s）。

式中空白组为无细胞的培养组。

1.6 细胞周期检测

取第3 代对数生长期瘢痕成纤维细胞，在培养皿中各加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，后吸弃之，将培养皿放入培养箱消化 2 min 后终止消化，制成2×107/mL 单细胞悬液，并接种于 6 孔培养板中。1640 培养液培养细胞 24 h 后换液，按实验分组，将3 种不同表面电位的驻极体作用于瘢痕成纤维细胞，干预 48 h 后于流式细胞仪进行瘢痕细胞的细胞周期分析。与DNA 结合的PI 荧光强度反映细胞内DNA 含量的多少。

1.7 细胞迁移能力检测

取瘢痕成纤维细胞，消化、离心后，制成细胞悬液，按5×104个/孔种植于6 孔板中，当细胞在 6 孔板内铺满至 80%时，于6 孔板中间划痕，并用 PBS 冲洗悬浮细胞。记录经表面电位为0 V、5 000 V 驻极体和-5 000 V 驻极体分别作用0、12 h和24 h 后的细胞迁移情况。

1.8 统计学处理

采用软件 SPSS Statistics 19 进行统计分析，选用方差分析（正态分布，方差齐性）。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 驻极体的电荷储存稳定性

经常温等离子体制备的不同表面电位正、负极性聚丙烯驻极体，其等温表面电位衰减曲线不再赘述[10]。实验表明常温充电的正、负极性聚丙烯驻极体具有良好的电荷储存稳定性，可以用于兔耳瘢痕模型。

2.2 驻极体对瘢痕增生指数的影响

图1分别显示了兔耳瘢痕创面在第1 天、第7天和第42 天的大体组织生长情况。兔耳创面形成瘢痕组织后的第4 周、第5 周和第6 周，经过不同极性的5 000 V 驻极体作用后，随时间增加，对照组瘢痕增生指数逐渐增大，说明瘢痕增生程度逐渐增加；且与对照组相比，正、负5 000V 组驻极体作用后的瘢痕增生指数均明显降低，说明不同极性的5 000 V 驻极体均对瘢痕生长有抑制作用，不同极性的5 000 V 驻极体的抑制作用差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

图1 兔耳瘢痕模型创面的大体组织生长情况。

表1 创面形成后4～6 周各组瘢痕增生指数变化情况（n=4，±s）

表1 创面形成后4～6 周各组瘢痕增生指数变化情况（n=4，±s）

*P<0.05 vs 对照组

组别 4 周 5 周 6 周对照组 3.49±0.03 3.65±0.03 4.30±0.07 5000V 组 2.80±0.04* 3.08±0.06* 3.67±0.09*-5000V 组 2.79±0.05* 3.11±0.07* 3.69±0.06*

2.3 驻极体对瘢痕细胞增殖率的影响

5 000 V组和-5 000 V驻极体分别作用瘢痕成纤维细胞24 h后，与对照组比较，经5 000 V驻极体作用24 h后，瘢痕成纤维细胞的OD值下降为0.96±0.02（P<0.05）。而经-5 000 V驻极体作用24 h后的瘢痕成纤维细胞，其OD值上升为1.05±0.03（P<0.05）。且随着驻极体与细胞作用的时间越长，其不同极性驻极体促进瘢痕成纤维细胞增殖或减少其增殖的作用有加强趋势（表2）。提示 -5 000 V组在较短时间内（72 h）对细胞增殖有促进作用，而5 000 V组则对细胞增殖有抑制作用。

表2 驻极体作用不同时间后瘢痕成纤维细胞的增殖率变化情况（瘢痕数n=12，±s）

表2 驻极体作用不同时间后瘢痕成纤维细胞的增殖率变化情况（瘢痕数n=12，±s）

*P<0.05 vs 对照组

组别 24 h 48 h 72 h对照组 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 5000V 组 0.96±0.02* 0.95±0.04* 0.92±0.04*-5000V 组 1.05±0.03* 1.07±0.04* 1.09±0.03*

2.4 驻极体对瘢痕成纤维细胞增殖周期的影响

5 000 V 组和-5 000 V 驻极体分别连续作用细胞48 h 后，与对照组比较，经-5 000 V 驻极体作用48 h 的瘢痕成纤维细胞群中处于G1 期的细胞比例从26.81%±0.44%上升至72.26%±0.32%；而G2 期的细胞比例也显著上升，从13.00%±0.13%增加至24.24%±0.73%，处于S 期的细胞数显著减少（图2）。

5 000 V 组作用成纤维细胞48 h，处于G1 期细胞的比例较对照组也有显著上升，从26.81%±0.44%上升至80.07%±0.02%，而G2 期的细胞有比较明显的下降，从13.00%±0.13%减少至10.07%±0.51%，处于S 期的细胞数稍有减少。这说明正极性驻极体产生的外静电场使细胞阻滞于G1 期而抑制细胞生长（图2）。

图2 驻极体作用于瘢痕成纤维细胞48 h 后的流式细胞图 （n=3）。

2.5 驻极体对瘢痕细胞迁移率的影响

与对照组比较，不同极性的5 000 V 组驻极体作用于瘢痕成纤维细胞较短时间内（12 h）后，细胞迁移程度比较有限，细胞迁移数目均较对照组减少。而-5 000 V 组驻极体作用12 h，其抑制瘢痕成纤维细胞定向迁移的效果比较明显（图3），说明在短时间内（12 h）负极性驻极体对瘢痕成纤维细胞的迁移有更强的抑制作用。

图3 驻极体作用各组瘢痕细胞12 h 后细胞迁移的变化（n=3）。

3 讨论

本研究从驻极体作用于瘢痕成纤维细胞的不同时间点展开，分别利用不同测量手段和方法从不同角度研究其作用机制。结果显示：具有良好电荷储存性能的正、负5 000 V 聚丙烯驻极体所提供的静电场，在伤口形成的较短时间内，有调控瘢痕细胞增殖的作用，但较长时间（4～6 周）的研究数据表明，不同极性的 5 000 V 驻极体均具有抑制瘢痕成纤维细胞生长的作用。此结果表明两者在作用期间的具体机制方面可能略有不同。

-5 000 V组驻极体在12～48 h作用时间内，可以在G1期促进遗传物质的复制，使细胞增殖率增加，但在S期则抑制DNA的过度合成，推测其可能使DNA合成减少或者使细胞DNA缩短停留在S期的时间，快速进入G2期，这与以前的研究结果有相似之处[14]。细胞迁移实验结果提示负极性驻极体具有更强地抑制瘢痕成纤维细胞迁移的能力，推测这不仅与上述促进蛋白等物质的合成有关，可能也与其电荷极性的调控有关[15-17]。电生理学研究表明细胞膜的电荷情况为内负外正，负极性驻极体由于其极性与细胞膜外电荷异性，为细胞迁移提供了方向[18]。但负极性驻极体与活细胞作用后的不同时间段，两者的相互作用随着伤口组织的变化而产生不同的效果，瘢痕成纤维细胞在负极性驻极体作用4～7周的长时间调控作用下，负极性驻极体显示出强大的调控性，瘢痕增生减少，抑制瘢痕生长。

5 000 V 驻极体在细胞增殖指数与增殖率方面与相同表面电位的负极性驻极体具有类似表现，而细胞周期检测结果显示正、负极性驻极体对细胞周期的作用存在差异。5 000 V 驻极体在G1 期促进蛋白等遗传物质的复制后，同样具有抑制DNA 过度合成的作用，但在G2 期的细胞数量较S 期并没有显著增加，推测其可能并不是通过促进细胞周期快速度过S 期进入G2 期起作用，仅是通过正极性静电场单纯抑制DNA 的合成。

综上所述，当细胞处于外静电场环境下，静电场作为外源刺激因子将引起瘢痕成纤维细胞的生长与迁移过程发生变化，且随着驻极体作用时间的不同，正、负极性驻极体对瘢痕成纤维细胞的调控作用不同，正、负极性驻极体对瘢痕成纤维细胞的细胞周期影响也略有不同。两种不同极性的驻极体有望分别应用于不同时期的瘢痕生长过程，最终抑制病理性瘢痕增生。