李 萌，姜恭好，段海燕

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150080）

基因编辑，又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术或过程。基因编辑技术通过插入和敲除基因、定点突变和碱基替换等对基因组靶位点进行一系列的人工修饰，以获得新的功能或表型，甚至创造新的物种，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力，尤其是在植物遗传改良和新品种培育方面应用十分广泛。

1 基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展

1.1 提升水稻育种速度和效率

近年将基于CRISPR/Cas9 系统的基因组定点编辑技术不断应用于水稻，用来深入研究水稻基因功能和精准培育水稻品种，而传统基因组编辑技术只可对水稻基因片段随机删除或插入，精准插入效率不高。Yuming Lu 等用硫代修饰和磷酸化修饰供体片段，成功提升敲入靶向的效率，对约1 400 株植株进行编辑，成功效率平均值为25%，高者可达47%；此方法还能够在4 个位点进行靶向敲入，改进该方法得到重复片段介导的同源重组方法，能够精准有效融合原位标签蛋白并实现片段的替换，该效率约为11%[1]。覃玉芬等通过CRISPR/Cas9 技术系统编辑水稻品种GXU41 中TMS5的两个靶点位，获得纯合突变的T0代阳性植株，并在T1代获得到无外源标记的植株[2]。由此证明该技术能够提升获得TGMS 系的效率。Yusong Lv 等同样利用该技术基因编辑定点突变OsPAO5，实验发现其启动子区域存在天然SNP 能够介导水稻中胚轴性状的驯化，在提升水稻出苗速率的同时，为后续耐直播水稻品种分子育种研究提供重要数据支撑[3]。

1.2 实现水稻的生长发育调节

季新等根据CRISPR 这项技术的基本原理，对水稻光敏色素互作因子OSPIL15的CRISPR 表达载体进行构建，创制OS0ZI5突变体并研究其对光信号调控的作用，将所获得的10 种OS0ZI5 突变体与野生型进行对比，发现突变型的粒长明显变长，株高明显变矮，实验表明该技术能够证明光信号对其突变体生长发育的调控作用[4]。杨柳等通过该技术及反向遗传学方法，针对OsMADS56基因设计特异性敲除靶位点，并构建该基因敲除载体，运用农杆菌介导法获得野生粳稻9522 背景的转基因苗。实验结果表明9 株OsMADS56转基因苗具有3 种纯合突变类型，对蛋白序列进行比对和分析，发现3 种类型突变都能够造成移码突变和蛋白翻译提前终止，引起保守结构域的缺失。因此判断水稻OsMADS56与拟南芥SOC1功能保守，能够调控水稻的花发育及开花时间[5]。贾辰昊等设计1对sgRNA序列并运用自然降温以获得双链sgRNA，并运用T4连接酶的作用与载体pHSN401相连，进行菌落PCR 测序后，将成功构建的CRISPR基因编辑载体转入农杆菌，获得水稻OsSAUR23基因的基因编辑突变体材料。实验结果表明CRISPR/Cas9 技术作用下的OsSAUR23基因在生长素响应信号通路中扮演重要角色[6]。杨平等运用CRISPR/Cas9 技术对水稻Wx、Badh2基因进行编辑，从而获得能够稳定遗传且直链淀粉含量较低的突变体，使此类稻米更受青睐，同时这项实验也为后续进一步开展稻米品质研究提供参考依据[7]。

1.3 实现载体构建和突变体创制

陈强等首先将水稻的多胚基因OsPE运用基因编辑技术进行载体构建，将模板OsU6a 进行两次PCR，成功构建表达盒，通过T4连接酶将表达盒连接至载体中，通过PCR反应、酶切和测序后，得到pYLCRISPR/Cas9-gRNA 的多胚基因载体，为深入研究多胚基因提供参考[8]。

王荃等研究发现DUFs 蛋白对生物成长有很大作用，运用基因编辑技术构建OsDUF393的载体，并通过农杆菌介导的方法将待转化品种中花11 进行转化，获得T0代水稻植株100 株，对其进行测序后发现确实存在碱基的变化，实验创制了基因突变体，并表明通过基因编辑技术确实使得OsDUF393基因得到了定向编辑效果[9]。同样运用该技术，惠索祯等将粳稻品种沈农265作为赤霉素2氧化酶基因OsGA2oxlO进行基因编辑的遗传背景，将获得的突变体进行PCR 后发现突变体基因的表达量相对于野生型表现出很明显的下降趋势。进一步分析发现基因在水稻幼穗部的表达程度相较于在叶鞘、根部、茎叶的表达程度不同。实验明确了该基因的功能，表明基因编辑技术确实能够调控GA2oxl0基因功能[10]。

为研究生长素对水稻生长的参与过程，王道洋等运用基因编辑技术对OsARF8靶点位进行设计并对其进行敲除。首先构建载体，然后运用农杆菌介导法对水稻品种9522 进行转入，随后筛选得到28 株转基因植株，进一步对OsARF8鉴定得到6 株在外显子174的区域内发生了碱基的缺失，而对碱基突变深入探究得到第7 个氨基酸发生变化，进而使得亮氨酸变化成为色氨酸，由该处及以后的氨基酸序列均发生移码的突变，发现在第123 的氨基酸发生提前终止，由此证明此突变体中的DBD 功能域无法全部表达，ARF8 蛋白的功能也同时受到影响[11]。本实验证明运用基因标记技术能够将水稻基因OsARF8敲除，为后续研究提供范本。陶英瑜等研究发现水稻种子的发芽率对直播影响较大，ABI5 的含量下降会使种子萌发速度和效率更高。通过基因编辑技术对OsABI5突变体进行构建，运用农杆菌介导法将所构建的OsABI5敲除质粒导入愈伤组织，得到osabi5-2突变体，观察后得出运用基因编辑技术确实能够对水稻种子萌发加以调控[12]。

1.4 实现水稻抗病目标改变

杨海河等使用CRISPR/Cas9 技术为患稻瘟病水稻的Pi21基因进行针对性地定点突变，从而能够得到抗稻瘟病的植株，在T0代即达到约87%的基因存在靶序列碱基的缺失。患病株系与抗病的株系在同样接种病菌情况下，表现出突变植株的抗性更强[13]。该实验结果成功获得抗病植株，为开展稻瘟病研究提供数据支持。

现有研究发现获得具有广谱抗病性的时间较长，而运用CRISPR 技术能使水稻对抗白叶枯病的广谱性得到提升。运用CRISPR 技术长时期监管水稻的白叶枯病获得许多专家教授的肯定。在T2代中突变型的水稻品质表现出蜡质状，并且直链淀粉含量呈大幅度降低，约降低为2%左右。实验实现了白叶枯病的广谱抗病性，也体现出运用CRISPR 技术确实能够在对Wx基因进行编辑后达到糯性品质的改良效果。

1.5 实现水稻品质提升

随着生活质量的提高，人们对水稻口感等品质方面的需求标准逐渐提升，香糯口感和长粒更符合市场需求。直链淀粉含量是一种研究判断水稻稻米品质的理化指标，而新的基因编辑技术使得快速高质量达到该目标成为可能，能够将多种品质性状同时加以改良，将控制水稻口感粒长的直链淀粉含量调控到适合的程度。

周鑫等运用CRISPR 技术对Wx基因进行分析以获得优质糯稻，将靶点位分别设置在该基因的7、8、11、12、2 和10 外显子的区域内，用基因编辑技术对表达载体进行构建，并运用农杆菌介导法将设计好的载体导入至准备好的水稻品种中，获得多株再生基因的植株。进一步分析表明，突变率整体走低，多数为小于30%，都位于2、11、7外显子区域内部，多数小于2 bp 的缺失或者插入，并且大多是纯合基因型或者是双等位的突变[14]。该研究发现在糯稻的新品种培育时，应多培育突变体并筛选合适的靶点位，以期达到糯性水稻标准。

东北地理与农业生态研究所实验证明，对Wx基因的不同靶点位分别设计PBE-TS2、1、3 载体，将其导入至目标水稻品种，突变型表现出其直链淀粉含量均有小幅度降低，TS2 尤为明显，下降幅度约为4%，且水稻收获后保持为透明状态[15]。同样的方法，对黑龙江省内水稻种植比例最大的品种进行基因编辑后发现直链淀粉含量的下降幅度与前面实验保持一致。

Yongjie Kuang 等培育出能够抑制杂草生长的水稻品种[16]。王海明等利用水稻基因NRR是调控根系生长的多效基因，同样运用CRISPR技术进行基因敲除，发现被敲除后的植株根系鲜重比野生型的植株更重[17]。

2 基因编辑技术研究进展

2.1 前两代基因编辑技术

基因编辑技术通过插入和敲除基因、定点突变和碱基替换等对基因组靶位点进行一系列的人工修饰，包括了先后发展的三代技术，分别为一代的ZFNs 基因编辑技术、二代的TALENs 基因编辑技术和三代的CRISPR/Cas9 基因编辑技术。三者原理和方式存在差异，但同样需要人工进行改造的序列特异性核酸内切酶的支持，在相应的目标基因组位置进行DNA 切割并引发双链的断裂。

ZFNs是基因编辑历史上的第一代技术[18]，是多种蛋白质中普遍存在的蛋白基序，通过介导蛋白质、核酸、小分子及其他蛋白质发挥特异相互作用。运用ZFNs技术能够进行基因敲除或者将目标基因导入，阻断基因的激活，使基因序列得到改造。同时ZFNs 存在一些不足之处，如ZFNs 在每次对DNA 片段进行剪切时无法充分依靠同源二聚体的形成，存在异源二聚体，极可能会造成脱靶效应，使得DNA 序列发生改变或者出现错配的情况，甚至产生较强细胞毒性和导致细胞凋亡。引外，ZFNs 对DNA 的特异性识别度较低，筛选出能够成功构建特异性且切割速度较高的ZFNs基因编辑技术无疑需要投入大量成本。

TALENs 是基因编辑历史上的第二代技术，由TAL 效应因子的DBD 及FokI 核酸内切酶的DNA 切割出来的结构域两部分构成。其中TALEN 又由3 部分构成，分别为核定位信号的N 端结构域、能够较为准确识别特定DNA 序列的串联TALE 重复序列的中央结构域及具有Fokl 核酸内切酶功能的C 端结构域。该项技术的优点是TALENs 的TAL 效应物为串联重复的识别碱基单元，较低的脱靶概率和较高的特异性、较为简单的载体构建方式和较低的成本，使得该技术更受青睐。

2.2 第三代CRISPR/Cas9基因编辑技术

2.2.1 技术原理

CRISPR/Cas 是一种适应性的免疫系统。追溯发现其存在于古细菌和原核生物细菌中，通过自身进化来抵抗入侵DNA 和病毒。该系统能够对外源DNA 进行识别、特异性切割，同时能够沉默外源基因表达。该系统由CRISPR 序列元件及Cas基因家族蛋白两部分构成。构成CRISPR 序列元件的是高度保守的重复序列、位于重复上游的引导序列及间隔序列相间排列。位于相同位点的重复序列高度保守，而具有较高多样性的是位于不同位点间的重复序列。CRISPR 位点附近存在着具有内切酶活性和核酸酶的Cas基因家族蛋白酶，使得DNA系列特异性得以修复。

通过转录加工成的crRNA 和反式激活tracrRNA 共同形成双元复合体结构sgRNA，进而由sgRNA 引导Cas9 蛋白酶的HNH，与crRNA 碱基互补配对的模板链可以被特异性地识别并实现切割；RuvC作用于切割第二条链特定位点，并通过体内NHEJ 修复机制使得基因突变得以引入。对此我们可以进行不同sgRNA 的设计，从而运用CRISPR/Cas9 对不同的DNA 碱基序列进行剪切获得新的突变体。

2.2.2 优缺点

CRISPR/Cas9 第三代基因编辑技术是新兴的定点基因编辑工具。CRISPR/Cas9 技术通过对内源基因进行编辑从而完成作物的遗传基因改良，利用短RNA 和核酸酶对特定靶标基因进行突变，并对无外源基因整合的编辑材料进行筛选，在保证不会影响基因组的其他位点前提下，实现DNA 修复系统对特定位点进行精确突变。CRISPR 技术因使用简便且效率更高的优点，被广泛应用于水稻和高粱等粮食作物的基因组编辑工作中，同时运用在对人类及动物细胞等多种生物进行定点修饰中，并且该技术能够避免传统转基因所导致的安全问题。但CRISPR/Cas9 技术存在小概率的脱靶现象，从而引起基因组非靶向位点的突变影响实验结果。如何实现运用HDR修复途径提高对基因编辑的效率、实现大片段插入和碱基替换仍需进一步研究。

2.2.3 主要类型

目前已发现三种类型的10个亚种系统。Ⅰ型存在于古生菌的大肠杆菌等细菌和铜绿假单胞菌中，包含Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7 等亚型。Ⅱ型仅存于嗜热链球菌等细菌基因组，包含Casl、Cas2、Cas9 等亚型。Ⅲ型存在于激烈火球菌等古生菌，包含Casl、Cas2、Cas6 等亚型。Ⅰ型和Ⅱ型的靶标类型均为DNA，Ⅲ型的靶标类型为DNA或RNA。

2.2.4 相关技术

发展基因编辑技术，也需同时发展相应的检测方式。焦磷酸测序是ATP 硫酸化酶、DNA 聚合酶、三磷酸腺苷双磷酸酶及荧光素酶等4 种酶参与化学反应的酶联级联测序技术，免除需要通过荧光标记的引物和电泳检测的方法对已知的短序列采取测序分析的环节，该技术具有快速准确分析和实时检测的优点，能够鉴别很多植物成分及其病原微生物，逐渐成为单核苷酸多态性进行基因分型和突变检测的方式之一。解美霞等在检测水稻PL3基因的靶向突变时采用CRISPR/Cas9 技术进行诱导，实验结果表明该技术能够根据所检测编辑的位点对编辑后的水稻及未被编辑的野生型水稻加以准确区分，与以往技术相比具有更高的效率和准确性，对水稻位点定性具有较广阔的前景[19]。

基因编辑技术的持续快速发展为进一步开展植物基因功能研究及作物的遗传改良奠定基础。已发展技术如PCR 法、电泳法和测序法具有操作较复杂、耗时较长和成本较高等系列问题，而PARMS 技术则是通过荧光检测的方式进行SNP 的基因分型，具有前面几种方法所不具备的优点。基于ARMS 技术开发的SNP基因分型技术PARMS，采用1 对通用荧光引物、1 对等位基因特异引物和1 条反向共用引物共5 种引物对SNP 和短Indel位点进行等位基因的特异性扩增，并采用荧光扫描进行基因分型。律文堂等同样利用该技术对水稻进行基因编辑，从而能够对植株进行基因分型，所得到的鉴定结果能够与电泳法、测序法结果吻合，充分证明了该技术能够对水稻进行植株编辑及对其后代进行基因分型，同时为其他作物进行后代编辑提供良好范本[20]。

3 展望

CRISPR/Cas9 技术为基因组定向修饰带来新突破，但该技术研究时间尚短，仍需深入探索。应引导我国从事水稻育种研发的种业公司和科研院所共同合作，引导CRISPR 技术与常规育种方法结合，通过设计多gRNA 靶向到单一基因，特异性的获得多遗传性状的各种组合。目前该技术在水稻育种的应用依赖于HNEJ 途径基因敲除，但如何更好运用HDR 实现大片段的插入和碱基替换依然有很大的可能性；并且该技术会有一定概率出现脱靶情况，引起基因组的非靶向位点的突变，造成研究结果不确定性。对未知领域应积极探索，目前各研究运用较为广泛的Cas9蛋白基本都来自于Ⅱ型CRISPR 技术，而Ⅰ和Ⅲ型仍有良好的发展潜力。同时，应注意运用该技术获得的转基因植株是否符合法律规定，不断提高无外源基因的水稻基因的效率和准确性，对可能出现的不良情况加以预测并及时干预。