■杜 涓 安晓萍 刘 娜 王 园 何香凝 齐景伟

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心，内蒙古呼和浩特 010018）

玉米作为我国主要的饲料作物，长期以来被广泛应用于畜牧业，玉米芯是玉米棒脱粒后剩余部分。我国玉米年产量超过2 亿吨，其中玉米芯产量约占10%，最终产量超2 000万吨[1-2]。研究表明，玉米芯中主要含有32%～36%的纤维素、35%～40%的半纤维素、17%～20%的木质素以及少量的灰分等成分[3]，作为饲料直接饲喂，不仅适口性差，而且粗纤维含量较高，动物的消化吸收率低，在生产中很少使用。因此，提高对玉米芯的深度开发利用具有重要意义。

多糖是一类由多个单糖分子缩合、失水而成，结构庞大且复杂的糖类物质，广泛存在于大自然中[4-6]。大部分多糖均具有一定的生物活性。研究证实，玉米芯多糖作为一种高附加值产品具有抗氧化、抗凝血和抗菌等生物活性作用[7-9]，其巨大的研究和开发价值引起了研究学者的广泛关注。玉米芯多糖的提取方法大致可分为物理法[10]、化学法[11-12]和生物法[13-14]三大类。物理法和化学法虽然有效但对工艺要求严格，如果超出工艺要求的范围可能引起多糖中糖苷键的断裂，对多糖的组成和活性有较大的影响。生物法中的酶法提取是一项近几年来作为天然植物分离提取的热门生物技术，相对于其他提取方法，具有反应条件温和、产物不易变性、提取效率高、方便简易等显著的优势[15-16]。酶可使玉米芯中的纤维素、半纤维素和木质素之间的化学键破坏，使活性成分充分地释放[17]。酶法提取的玉米芯多糖的抗氧化能力需要评价，因此本试验通过酶解提取玉米芯多糖，分析其结构特性，以半抑制浓度（IC50）为参考依据，对比与原料玉米芯多糖的体外抗氧化能力的差异情况，为玉米芯的高附加值开发利用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米芯、玉米、豆粕和麸皮均购于市场。纤维素酶购自夏盛（北京）生物科技开发有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解玉米芯的制备

将原料按照一定的配比称量（65%玉米芯粉+20%玉米粉+10%豆粕粉+5%麸皮），混匀得到原料玉米芯，再加入纤维素酶1 000 U/g，混匀后加入35%的水充分搅拌，pH 为5.0，放入55 ℃培养箱中酶解20 h后得到酶解玉米芯。

1.2.2 玉米芯多糖粗提物的制备

将酶解玉米芯45 ℃烘干后粉碎，取2 g原料和酶解玉米芯分别加入20 mL纯化水，80 ℃水浴30 min后离心（5 000 r/min，10 min），取上清液，冷冻干燥得到原料和酶解玉米芯水提物。

采用Sevage法去蛋白，将上步得到的原料和酶解玉米芯水提物使用纯化水复溶成40%的溶液，离心得到上清液，分别与Sevage 试剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）3∶1混合，磁力搅拌器振荡30 min后离心收集上清液，再加入Sevage 试剂按比例混合，重复3 次后收集最后一步的上清液，旋转蒸发浓缩后冻干，加入4 倍体积的乙醇，醇沉12 h，将沉淀再次冻干，即得到原料和酶解玉米芯粗多糖。

1.3 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[18]。将原料玉米芯和酶解玉米芯水提物的上清液稀释60 倍，取0.5 mL 样品稀释液补水至1 mL，加入0.5 mL 5%苯酚和2.5 mL 浓硫酸，20 min后于490 nm下测吸光度。

1.4 结构分析

1.4.1 红外光谱

将1～2 mg的原料玉米芯和酶解玉米芯多糖分别和100 mg的溴化钾混匀，在研钵内研磨，取少许放在模具中压片，于400～4 000 cm-1区间进行红外光谱扫描。

1.4.2 扫描电镜

取适量的原料玉米芯和酶解玉米芯多糖样品粘在样品座上，用洗耳球吹去浮样，使用扫描电镜观察其表观形貌。

1.5 体外抗氧化能力的测定

1.5.1 DPPH自由基清除率的测定

试验方法参照Zhongshan 等[19]。将原料、酶解玉米芯多糖及对照丁基羟基茴香醚（BHA）分别配制成0.5、1、2 mg/mL 和4 mg/mL 浓度的样品溶液。各取2 mL，依次加入2 mL DPPH试剂，混匀后于室温下反应30 min。在517 nm处测其吸光度，即为A0。95%乙醇代替DPPH测得的吸光度即为A1，纯化水代替样品测得的吸光度即为A2，根据清除率计算得半抑制浓度。

计算公式：DPPH清除率（%）=[1-（A0-A1）/A2]×100

1.5.2 羟基自由基的清除能力

试验方法参照Singh等[20]。将原料、酶解玉米芯多糖及对照BHA分别配制成0.5、1、2 mg/mL和4 mg/mL浓度的样品溶液。取样品溶液0.5 mL 加入0.5 mL 9 mmol/L的硫酸亚铁溶液，0.5 mL 8.8 mmol/L的过氧化氢溶液，室温反应10 min。加入0.5 mL 的9 mol/L的水杨酸乙醇溶液，在室温条件下反应30 min，于510 nm处测其吸光度，OD值即为A1，纯化水代替样品的吸光度即为A0。纯化水代替硫酸亚铁溶液的吸光度即为A2，根据清除率计算得半抑制浓度（IC50）。

羟基自由基清除能力（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.3 还原力

试验方法参照参考黄忠等[21]。取样品溶液0.75 mL加入0.75 mL磷酸缓冲液，0.75 mL六氰合铁酸钾溶液，50 ℃反应20 min。加入10%的三氯乙酸溶液0.75 mL。取1.5 mL 最终上清液，加入1.5 mL 蒸馏水和400 μL 0.1%氯化铁溶液，室温反应10 min。在700 nm 处测其吸光度。

1.6 统计分析

试验所有数据均采用SAS 9.2 进行单因素方差分析；采用SPSS 21.0 进行IC50值分析。

2 结果与分析

2.1 酶解玉米芯多糖含量（见图1）

由图1可见，酶解玉米芯多糖含量显著高于未酶解的原料玉米芯多糖含量（P＜0.05），原料玉米芯多糖含量为75.45 mg/g，酶解玉米芯多糖含量为245 mg/g，玉米芯酶解后其多糖含量提高了224.7%。

图1 酶解玉米芯多糖含量

2.2 玉米芯多糖的红外光谱分析结果

原料和酶解玉米芯多糖在4 000～400 cm-1范围内的红外吸收光谱图见图2。图2可见，在两种多糖的红外光谱中，波长范围3 600～3 200 cm-1处出现一宽峰，这是O—H 和分子内或分子间氢键的伸缩振动吸收峰[22]，2 900～3 000 cm-1处有吸收峰，表明有糖类—CH2或—CH3的C—H伸缩振动和弯曲振动[23]；1 617.32 cm-1处强的吸收峰是糖苷部分C＝O 伸缩振动吸收峰[24]。在1 400 cm-1左右较尖的吸收峰是C-H 变角振动吸收[25]；在1 250～950 cm-1之间是吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰，表明糖链存在吡喃糖构型[26]。以上这些是糖类物质的特征吸收峰，从而确定这两种物质均是多糖。

图2 酶解和原料玉米芯多糖红外光谱图

2.3 玉米芯多糖的扫描电镜结果（见图3）

由图3 可见，图A 表示为原料玉米芯多糖，A1 和A2 为500×和1 000×下原料玉米芯多糖，可以看到表面光滑、孔洞松散、孔径小、质地坚硬。图B表示为酶解玉米芯多糖，由图B1（500×）和B2（1 000×）可以看出，在不同放大倍数下，酶解后的玉米芯多糖样品的表面粗糙，立体结构均出现疏松、裂缝和较大程度的断裂现象，表面积增大。

图3 电子显微镜扫描结果

2.4 DPPH自由基清除率（见图4）

图4 酶解和原料玉米芯多糖DPPH自由基清除能力

从图4可知，酶解玉米芯多糖浓度范围0～4 mg/mL，随着浓度增加，对DPPH 自由基清除能力均快速上升，呈剂量依赖式增长，在浓度4 mg/mL 时，对DPPH自由基清除率为91.5%，与对照BHA相比差异不显著（P＞0.05）。原料玉米芯多糖对DPPH自由基清除能力也持续上升，但显著低于酶解玉米芯多糖（P＜0.05）。酶解玉米芯多糖对DPPH 自由基清除能力的IC50为0.694 mg/mL，原料玉米芯多糖对DPPH自由基清除能力的IC50为1.330 mg/mL。

2.5 羟基自由基清除率（见图5）

图5 酶解和原料玉米芯多糖羟基自由基清除能力

从图5 可知，酶解和原料玉米芯多糖对羟基自由基清除率范围0～4 mg/mL，随着浓度增加，呈上升趋势，并显示出一定的量效关系。在2～4 mg/mL 时，原料玉米芯与酶解玉米芯多糖对羟基自由基清除率显著高于对照BHA（P＜0.05）；酶解玉米芯多糖对羟基自由基清除能力的IC50为0.982 mg/mL，原料玉米芯多糖对羟基自由基清除能力的IC50为1.071 mg/mL。

2.6 还原力（见图6）

图6 酶解和原料玉米芯多糖还原力

由图6 可见，随着样品浓度的增加，还原力逐渐增强，最后趋于稳定，当浓度达到4 mg/mL时，酶解玉米芯多糖的吸光度值为0.946，原料玉米芯多糖的吸光度值为0.899，但显著低于阳性对照BHA（P＜0.05）。

3 讨论

本试验中，通过纤维素酶酶解玉米芯，使得玉米芯多糖含量得到了大幅的提高，这是由于纤维素酶降解了植物细胞壁和细胞膜，减少提取时来自细胞壁、细胞膜和细胞间质的阻力，使有效成分得到释放[27]，同时酶的使用也可将部分多糖由大分子降解为小分子物质，从而更有利于多糖从细胞内分离出来[28]。与本研究结果相似，段宙位等[29]和邓桂兰[30]的研究表明，酶法提取可提高多糖的提取率，增强抗氧化能力且效果优于其他方法。皮双双等[31]研究发现，使用酶法提取黑糯玉米芯中的可溶性膳食纤维得率可达4.36%，具有良好的体外抗氧化活性。

红外吸收光谱是鉴定生物大分子结构最常用的方法，在红外线照射下分子中的不同化学键吸收的频率不同，由此来确定化学键或官能团种类的信息[32]。结果表明酶解和原料玉米芯多糖的红外图谱比较相似，均出现了多糖的特征吸收峰。此外，从图2 发现原料玉米芯多糖在1 165 cm-1（酯键反对称的C—O拉伸振动）处存在一个小的吸收肩峰，而在酶解玉米芯多糖中此峰几乎消失。此现象表明在原料玉米芯多糖中仍保留部分酯键，而玉米芯在酶解后，木质素酯键断裂。总而言之，红外图谱表明，玉米芯经过酶解后可以破坏木质素的结构，释放出更多的多糖，多糖含量结果也证实了这一现象。

玉米芯的内部结构复杂，木质素作为一个坚固的屏障，紧密包围起纤维素和半纤维素[33]。因此，去除纤维屏障是提高玉米芯中多糖含量的有效方法。扫描电镜结果显示，原料玉米芯多糖表面较光滑平整，结构较完整，表面有空洞可能是在提取和纯化玉米芯多糖过程造成的影响，酶解后玉米芯多糖的立体结构遭到破坏，表面产生很多空隙，平整的表面消失、断裂，甚至变成碎小颗粒。可能酶解技术可造成多糖聚集体的破坏，将聚集体分成链条状或小颗粒的碎片等[33]，从而使多糖得到了充分释放，抗氧化能力增强。这些结果与何香凝等[33]研究微生物发酵对玉米芯木聚糖的表观结构的影响结果相似。

目前，测定样品对自由基的清除能力和还原力是使用最广泛的评价抗氧化活性的方法[35]，Melo-Silvei⁃ra 等[36]发现使用甲醇提取的玉米芯提取物不具有清除羟基自由基的能力，但在总抗氧化能力和清除DPPH 能力测试中表现出较强的抗氧化活性，与抗坏血酸相比，其具有更高的还原能力和较强的超氧化物清除能力[37]。本试验中应用酶法酶解玉米芯，通过粗提取得到酶解玉米芯多糖，并以相同提取方法获得原料玉米芯多糖与之对比，结果显示，酶解和原料玉米芯多糖均具有较好的DPPH自由基清除能力，并随着样品浓度的升高快速增强，最终各组样品对DPPH自由基的清除能力均接近于BHA；并且在羟基自由基清除能力结果中当样品浓度为2～4 mg/mL 时，酶解和原料玉米芯多糖的抗氧化能力均高于BHA，酶解玉米芯多糖对DPPH 自由基和羟基自由基的清除能力均高于BHA。还原能力是指化学反应中Fe3+还原成Fe2+失去电子的能力，失去电子的能力越强，还原性就越强，测得吸光度就越高[36]，研究结果显示酶解后玉米芯多糖的还原力较未经酶解玉米芯多糖的效果好，这说明酶解玉米芯多糖对铁原子有很大的供电子能力，在此条件下提取物可作为抗氧化剂。

4 结论

使用纤维素酶酶解后的玉米芯通过提取得到的多糖较未酶解的玉米芯多糖含量更高，为245 mg/g，红外图谱分析发现酶解和原料玉米芯多糖均出现了多糖的特征吸收峰，且糖链为吡喃糖构型，扫描电镜结果表明酶解后玉米芯多糖的结构受到破坏，表面断裂，变成颗粒状，较原料变化较大，酶解后的玉米芯多糖具有更强的DPPH自由基、羟基自由基和还原力，IC50值分别为0.694 mg/mL和0.982 mg/mL。这从某种意义上说明使用纤维素酶酶解玉米芯可以破坏其内部结构，多糖得到了充分释放，从而增强了抗氧化能力。