汤雅淇，李珂，艾军，严红亚，信爱国*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201； 3.昆明海关技术中心，云南 昆明 650200)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。该病传播速度快、流行范围广，病毒可通过接触易感动物和空气传播，易感动物接触病毒后2～3d产生临床症状，发病率为100%，幼畜经常不见症状而猝死，死亡率因病毒株而异，严重时可达100%。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)成员，基因组为一长约8 500 bp的单股正链RNA分子[1]。FMDV目前已知有7个不同的血清型(A、O、C、Asia1和南非1、2、3型)，在每个血清型内存在多种亚型，不同血清型间无交叉免疫性。目前，O型FMDV存在10个不同拓扑型，即中东-南亚 (ME-SA)、东南亚 (SEA)、古典中国拓扑型(CATHAY)、欧洲-南美 (Euro-SA)、印度尼西亚-1(ISA-1)、印度尼西亚-2 (ISA-2)、东非-1 (EA-1)、东非-2 (EA-2)、东非-3 (EA-3)、西非拓扑型(WA)[2]。我国毗邻的东南亚、南亚地区O型病毒变异频繁，存在病原生物多样性[3,4]，区域内FMD流行处于流行毒株多元化时期，不同血清型、不同遗传谱系、不同进化阶段的病毒混杂存在，各自循环，形成了复杂难解的防控局面[5-7]。

预防、控制和消灭FMD是我国兽医研究的重大课题，其中研发口蹄疫的快速诊断、定型技术具有十分重要的临床意义。单克隆抗体(monoclone antibody, mAb)能够识别单一抗原位点，与抗原结合的特异性强。目前，国内诸多具有代表性的研究制备了多种抗口蹄疫病毒的单克隆抗体，用于FMDV诊断定型、抗体水平监测、疫苗免疫动物与自然感染的鉴别诊断、抗原表位分析等方面[8-14]。

为建立FMDV检测方法，本研究用纯化的O型兔化弱毒FMDV云南太保株(Yunnan Taibao attenuated strain, YNTBa)作为抗原，制备了1株O型FMDV的特异性mAb，分析了其生物学特性，为O型FMDV的诊断及其抗原位点研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1主要试剂

HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG、弗氏完全和弗氏不完全佐剂、PEG(Mw，1500和6000)、HAT(50×)、HT(50×)选择培养基均购自Sigma公司；IMDM高糖培养基和优质胎牛血清(FBS)为GIBCO公司产品；其他化学试剂均为分析纯；免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒购于RoChe公司。

1.1.2细胞、毒株及实验动物

BHK-21细胞本实验室冻存；SP2/0骨髓瘤细胞由昆明海关动物检疫实验室提供；BALB/c小鼠购于昆明医科大学动物实验中心；O型FMDV兔化弱毒云南太保株(YNTBa)适应于BHK-21细胞备用，由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1FMDV抗原制备

将YNTBa病毒(毒价为10-5.6TCID50/0.1 mL)按照MOI=0.01 TCID50剂量接种长满单层的BHK-21细胞，于37℃、5% CO2培养16～18h后出现CPE，收集病变细胞，冻融2次，4℃、9000r/min离心1 h，收取上清用BEI灭活处理；灭活液按照比例加入80g/L PEG-6000和40g/L NaCl，4℃搅拌并放置12h; 次日4℃ 9000r/min 离心90min，回收沉淀，用NTE缓冲液重悬，然后4℃、29000r/min离心2h，弃上清；沉淀用NTE缓冲液浸泡，4℃过夜，次日重悬，充分混合均匀分装，-70℃冻存备用。经PEG-6000沉淀纯化病毒，测定蛋白含量，作为小鼠免疫抗原和ELISA包被抗原。

1.2.2间接ELISA检测方法的建立

间接ELISA方法，采用方阵滴定法确定纯化YNTBa抗原和抗体的最适工作浓度；用包被液按1∶50倍比稀释抗原，包被酶标板；BALB/c小鼠阳性血清和阴性血清均做倍比稀释，同时设立骨髓瘤细胞培养上清和空白对照；酶标二抗工作浓度1∶5000，TMB显色后置于450 nm处读取吸光值，P/N值最大的抗原稀释度为最适浓度。

1.2.3动物免疫

取纯化的YNTBa病毒抗原免疫BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原，按0.5mL/只(含抗原量50μg)皮下多点注射；间隔2周后，第2次免疫，用弗氏不完全佐剂乳化抗原，剂量途径同上；间隔2周，第3次免疫，不加佐剂，剂量同上，腹腔注射。2周后尾部采血，分离血清，测定免疫小鼠血清抗体水平效价。取抗体效价最高的小鼠于融合前3d进行加强免疫，腹腔注射纯化抗原，剂量100μg/只。

1.2.4细胞融合

加强免疫前1d，取正常BALB/c雌鼠腹腔细胞，按照常规方法制备饲养层细胞。加强免疫3d后，取血清效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞按6∶1的比例混合，按照常规方法进行融合后，加入铺有饲养细胞的96孔板，放置于含5% CO2培养箱37℃培养。第2天用HAT培养基进行半数换液，根据细胞状态10d左右完全更换HT培养基进行培养。杂交瘤细胞孔适时进行转移并扩大培养，采用间接ELISA和IFA方法检测抗体，阳性孔适时进行亚克隆，直到获得分泌稳定的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株[13]。

1.2.5单克隆抗体腹水的制备及纯化

将0.5mL的灭菌液状石蜡注射到10～12周龄小鼠腹腔，1周后，按1×106/只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，7～10d后，抽取腹部极度膨胀小鼠腹水， 37℃ 2～4h，随后置4℃过夜，次日10000r/min 离心10min取上清，用ELISA方法检测效价，再采用辛酸-饱和硫酸铵法进行提纯，-70℃分装保存。

1.2.6单克隆抗体效价的测定

用间接 ELISA 方法测定，细胞培养上清与腹水分别进行倍比稀释，同时分别以 SP2/0 细胞培养上清和腹水做同等稀释度作为对照。

1.2.7单克隆抗体亚类鉴定

按照抗体亚类鉴定试剂盒说明书，对所获得的单克隆抗体进行抗体亚类鉴定。

1.2.8Western-blot分析

按照常规方法，将纯化的YNTBa病毒进行SDS-PAGE电泳和转印。转印后用含5%脱脂乳的PBS 37℃封闭1h，用TBST充分洗涤后加入1∶1000倍稀释的腹水单克隆抗体37℃摇床作用10min，4℃过夜，充分洗涤3次后加入1∶5000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃作用40min，洗涤3次后用DAB显色。

1.2.9单克隆抗体相对亲和力测定

采用NaSCN洗脱法测定mAb的相对亲和力，用间隔0.5mol/L连续浓度的NaSCN分别对腹水上清和SP2/0腹水上清与抗原形成的复合物进行洗脱，测定洗脱后抗体与抗原反应的OD450值。当OD450值下降到不经洗脱时的50%时，对应的NaSCN浓度即为抗体的相对亲和力常数，以mol/L表示。

1.2.10单克隆抗体型特异性鉴定

采用IFA方法检测，按本实验室方法进行[15]。用O型的YNTBa病毒和A型FMDV毒株感染BHK-21细胞，同时设正常细胞对照，用冰冷无水乙醇固定10min，晾干后加入待检测杂交瘤细胞上清。37℃作用40min，PBS洗涤后加入羊抗鼠FITC标记的IgG，37℃、40min，PBS洗涤后于荧光显微镜下观察。

1.2.11单克隆抗体中和特性测定

按照常规病毒中和试验进行，96孔微量板中加入50μL纯化单克隆抗体，进行10倍连续倍比稀释，每个稀释度4孔；上述各孔中加入100 TCID50的YNTBa病毒50μL混合，37℃作用1h, 接种长满单层BHK-21细胞的96孔板，37℃、5% CO2培养箱中培养观察CPE。同时设立阳性、阴性血清对照、病毒对照和正常细胞对照。

2 结果

2.1 抗原制备及小鼠免疫

BHK-21细胞培养收获YNTBa病毒，经差速离心、PEG-6000沉淀纯化抗原，制备获得病毒抗原。按照免疫程序，经3次免疫后的5只BALB/c小鼠间接ELISA测定血清效价。结果显示：5只小鼠血清效价≥10-4稀释度中，4号和5号小鼠较其他小鼠高，首选为试验用鼠(图1)。

图1 小鼠血清10-4稀释抗体效价

2.2 杂交瘤细胞株的建立

免疫小鼠脾细胞和SP2/0杂交瘤细胞按6∶1的比例混合融合，分散于10块96孔板中培养；杂交瘤细胞培养上清经间接ELISA检测，当杂交瘤细胞上清对YNTBa抗原与小鼠阴性血清、SP2/0细胞上清对YNTBa抗原OD值之比均大于2.1，判为阳性杂交瘤细胞。再经筛选及3次有限稀释法克隆，结果获得1株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，命名为9B3。

2.3 杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价测定

采用间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价，将其分别进行倍比稀释，测定OD450值；同时设立阳性、阴性血清对照。检测样品与阴性血清的OD450值(P/N)之比大于2.1时的mAb最大稀释度确定为其ELISA效价。结果显示：9B3杂交瘤细胞培养上清效价为1∶25 600，腹水效价为1∶106。

2.4 单克隆抗体亚类鉴定

对获得的9B3单克隆抗体进行亚型鉴定，结果显示，此9B3单克隆抗体的重链类型为IgG2a, 轻链类型为κ(图2)。

图2 单抗亚型鉴定图

2.5 Western-blot分析

用纯化的YNTBa抗原进行SDS-PAGE电泳，在电转印至PDVF膜上进行Western-blot分析。结果显示：9B3单克隆抗体与O型FMDV YNTBa病毒无特异性条带，表明该单抗所针对的抗原位点为空间构象表位。

2.6 单克隆抗体的相对亲和力

分别用连续间隔0.5mol/L的不同浓度NaSCN对单抗9B3和SP2/0腹水进行洗脱，经测定9B3单克隆抗体的相对亲和力指数为1.0mol/L(图3)，表明9B3单抗具有中等强度的亲和力。

图 3 单抗9B3的相对亲和力指数测定结果

2.7 单克隆抗体血清型特异性鉴定

将9B3单克隆抗体分别作用于感染O型FMDV YNTBa病毒和A 型FMDV的BHK-21细胞，进行IFA检测。结果显示：9B3对YNTBa可以产生特异性荧光，而与A型FMDV不产生荧光反应(图4)。表明9B3单克隆抗体只针对O型FMDV起反应，具有病毒型特异性。

A：感染O型FMDV的BHK-21细胞与mAb 9B3的反应结果；B：感染A型FMDV的BHK-21细胞与mAb 9B3的反应结果。

2.8 单克隆抗体中和特性的检测

运用微量病毒中和试验鉴定9B3单克隆抗体的中和活性，对照阳性血清中和效价≥1∶32判为阳性，<1∶32判为阴性。结果显示：O型FMDV阳性血清、空白、细胞和病毒对照均成立，此单克隆抗体中和性>1∶32，表明9B3不具备中和活性。

3 讨论

试验研究的目的是制备抗O型FMDV的特异性mAb，期望筛选出具有型特异性、识别谱广、能够用于开发检测O型FMDV抗体的ELISA试剂盒。单抗制备免疫原O型FMDV兔化弱毒YNTBa病毒，来源于1958年云南保山地区流行的牛O型FMDV分离株，牛源强毒经适应3～5日龄乳兔后，连续传代480代次以上，对牛源宿主毒力减弱，后再次适应BHK-21细胞[16]。YNTBa毒株全基因序列(GenBank No. KY072818)分析显示该毒株属于O型Cathay遗传进化系谱较早的流行毒株[17]，与后期流行的O型Cathay系谱毒株的致病宿主与抗原差异明显[2]。本文选择制备该毒株单抗，还有用于分析该遗传系谱毒株遗传进化抗原识别位点变异加剧趋势的研究。同时，该毒株具有良好的免疫原性，免疫小鼠能够获得高的抗体效价(图1)，保证免疫小鼠与杂交瘤细胞融合，获得阳性分离株。同时，在制备过程中发现，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞合适的比例融合，也是成功获得杂交瘤细胞的关键点。

试验获得1株抗O型FMDV的mAb 9B3，IFA试验结果表明其具有型特异性(图4)，推测其识别的抗原位点位于FMDV的衣壳蛋白上。但是病毒中和试验表明该单抗不具有中和活性，而且根据Western-blot结果分析，9B3结合的位点属于空间构想表位。FMDV mAb结合表位的保守性是其作为诊断试剂、选择合适mAb的重要因素，下一步深入分析FMDV mAb 9B3识别的抗原位点，对于评估其作为广谱抗原识别位点、研发检测ELISA试剂具有科学意义。此外，本文尚不能确定该单抗识别不同O型FMDV遗传系谱毒株的能力，特别是近年主要流行的SEA、ME-SA(含泛亚-1和泛亚-2)拓扑型的识别能力，有必要针对不同流行毒株制备不同批次单克隆抗体，研究其识别的不同免疫优势位点，增加基于单抗建立血清学检测方法的灵敏度。

试验制备获得1株针对O型FMDV的单克隆抗体杂交瘤细胞株9B3；该单抗属于IgG2a/κ亚类，具有FMDV血清型特异性、不具有病毒中和活性，识别非线性的抗原表位。该单抗为O型FMDV抗原表位研究及检测方法的建立奠定了基础。