霍甜甜，李宜鲜

（河南省食品药品检验所 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，河南 郑州 450009）

斑秃丸是由地黄、熟地黄、制何首乌、当归、丹参、炒白芍、五味子、羌活、木瓜九味药物组成，具有补益肝肾、养血生发的功效，收载于《中国药典》2020年版一部。《中国药典》[1]中仅规定了2, 3, 5, 4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）的定量测定方法，并在鉴别项下规定了当归、丹参、炒白芍和制何首乌的薄层色谱（TLC）质量控制方法，其余药材未见涉及。但TLC不能准确定量，且实际操作过程较复杂，耗时长，受实验环境影响较大。有文献报道对该制剂白芍所含芍药苷进行定量研究[2]；对熟地黄、地黄所含主要成分梓醇、麦角甾苷、吉奥诺苷B1、马替诺皂苷，制何首乌所含主要成分二苯乙烯苷、大黄素甲醚，白芍所含指标性成分芍药苷同时进行定量测定研究[3]。前者测定成分较单一，后者仅控制地黄、熟地黄、制何首乌和炒白芍的组分含量，涵盖的药物组分较少。

多指标成分测定能更好地从整体上控制中成药的内在质量[4-10]，且尽量选取不同药材中的组分进行测定，可更加全面地反应药品质量，以保证疗效。在参考现有文献的基础上，本试验选取地黄和熟地黄中的毛蕊花糖苷[11-12]，制何首乌中的二苯乙烯苷和大黄素[13]，当归中的阿魏酸[14]，丹参中的丹参酮IIA和丹酚酸B[15]，炒白芍中芍药苷[16]，五味子中的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素[17-18]，羌活中的异欧前胡素[19]作为斑秃丸的指标性成分。采用高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱，首次建立了HPLC同时测定斑秃丸中的芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素11种活性成分的测定方法，为更加全面地控制其内在质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司，2998二极管阵列检测器）；XP105电子天平（瑞士 Mettler 公司）；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅 （上海跃进）；Milli-Q 超纯水处理系统（德国Millipore公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201943，含量95.1 %），毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201512，供含量测定用），阿魏酸对照品（批号：110773-201915，含量99.4 %），丹酚酸B对照品（批号：111562-201716，含量94.1 %），五味子醇甲对照品（批号：110857-200507，供含量测定用），大黄素对照品（批号：110756-201913，含量96.0 %），异欧前胡素对照品（批号：110827-201611，含量99.4 %），五味子甲素对照品（批号：0764-200005，供含量测定用），丹参酮IIA对照品（批号：110776-201721，含量99.5 %），五味子乙素对照品（批号：110765-200205，供含量测定用），均购自中国食品药品检定研究院；二苯乙烯苷对照品（批号：16081510，HPLC纯度≥98 %，成都普菲德）；斑秃丸（广州白云山敬修堂药业股份有限公司，规格：每10丸重1 g，批号分别为B08030，B06026，B06019，B12053，B04013，B04008，B01005）；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，10 %A～15 %A；5～20 min，15 %A～55 %A；20～35 min，55 %A～75 %A；35～40 min，75 %A～80 %A；40～50 min，10 %A）；流量为1.0 ml/min；进样量为10 μl；检测波长为220 nm；柱温为35 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA、五味子乙素的对照品适量，精密称定，用50 %甲醇溶解，并配制成浓度分别为0.520，0.546，1.036，0.679，0.080，1.047，0.178，0.605，1.341，0.108，1.592 mg/ml的单标贮备液。再依次取上述各贮备液适量，置于同一10 ml量瓶中，用50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液（芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA、五味子乙素的浓度分别为51.982，21.840，103.600，6.789，47.878，20.940， 7.127，18.160，6.705，3.248，7.960 μg/ml），备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品30丸，研细混匀，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，摇散药粉，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按斑秃丸处方比例及工艺，分别制得缺地黄与熟地黄、制何首乌、当归、丹参、炒白芍、五味子、羌活的阴性样品，按2.2.2项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，按2.1项色谱条件进样测定，结果见图1。结果显示，各成分色谱峰之间的分离度均大于1.5；在与上述11种对照品色谱峰相应的保留时间处，阴性样品溶液没有对应的色谱峰，即阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 斑秃丸中11种活性组分含量测定的HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液1，2，5，10，15，20，25，30 μl注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以进样量（X，ng）为横坐标，相应峰面积（Y）为纵坐标，分别绘制各成分的标准曲线，结果见表1，可知各成分在各自进样量范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样 6 次，记录芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素的峰面积，测得11个组分峰面积的RSD值依次为1.46 %，0.57 %，0.28 %，0.66 %，0.91 %，0.74 %，1.49 %，2.01 %，0.84 %，0.35 %，1.52 %，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取丸剂（批号：B08030），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于 0，4，8，12，18，24 h按2.1项下色谱条件进样测定，测得芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮ⅡA和五味子乙素峰面积的RSD依次为1.08 %，1.69 %，1.02 %，0.84 %，0.57 %，0.75 %，1.52 %，0.76 %，0.68 %，0.89 %，1.33 %，表明供试品溶液在制备后室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批丸剂（批号：B08030），按2.2.2项下方法制备 6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，测得斑秃丸中芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素的平均含量分别为1.790，0.397，2.364，0.146，3.942，0.642，0.198，0.487，0.111，0.116，0.188 mg/g，RSD依次为1.90 %，1.84 %，2.34 %，1.58 %，1.07 %，2.32 %，2.11 %，、0.86 %，1.36 %，1.44 %，2.47 %，表明本方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验 取同一批各成分含有量已知的丸剂（批号：B08030），研细，分别取6份粉末，各约0.5 g，精密称定，精密加入对照品溶液（含芍药苷0.894 mg/ml、毛蕊花糖苷0.186 mg/ml、二苯乙烯苷1.173 mg/ml、阿魏酸0.074 mg/ml、丹酚酸B 2.088 mg/ml、五味子醇甲0.309 mg/ml、大黄素0.101 mg/ml、异欧前胡素0.240 mg/ml、五味子甲素0.052 mg/ml、丹参酮IIA 0.057 mg/ml、五味子乙素0.103 mg/ml）各1 ml，按 2.2.2项下方法制备加样回收供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果芍药苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黄素、异欧前胡素、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素的平均回收率分别为97.64 %，102.61 %，96.95 %，98.23 %，95.64 %，99.53 %，97.90 %，99.02 %，103.55 %，102.31 %，100.24 %，RSD分别为1.54 %，2.75 %，1.11 %，1.78 %，2.24 %，1.45 %，3.04 %，2.70 %，1.87 %，2.88 %，2.47 %（n=6）。

2.4 样品含量测定

分别取7批斑秃丸，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，外标法计算各成分含量，结果见表2。

表2 斑秃丸中11种成分的含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 梯度洗脱条件筛选

本试验首先考察了流动相甲醇-水、乙腈-水[1]、乙腈-甲醇-水3种流动相系统对各成分的分离效果，结果乙腈-水系统对各成分的分离效果最好，各组分色谱峰间分离度均大于1.5；再考察了水、0.1 %磷酸溶液、0.2 %磷酸溶液和0.3 %磷酸溶液作为水相时对各色谱峰的影响，结果0.1 %～0.3 %磷酸溶液均能改善色谱峰的峰型，最终选择乙腈-0.1 %磷酸溶液作为流动相。试验过程中，尝试通过增加流动相中乙腈的比例，使各成分均能更早出峰，且各峰分离度均大于1.5，但在专属性试验过程中发现，部分成分的色谱峰受未知峰的干扰较大，专属性不强；尝试将图1所示20 min后的目标成分色谱峰出峰时间提前，结果7号和10号峰易受未知峰的干扰，无法达到基线分离。经进一步研究，采用2.1项下梯度洗脱条件时，各目标峰峰型和分离度均良好，专属性试验无干扰，因此选择该条件作为最终的色谱条件。

3.2 提取方法的选择

按回流提取法提取供试品，考察了提取时间为20，40，60 min时的各成分提取率，结果当提取时间为60 min时，各成分的提取率均能达到97 %以上，因此确定最佳提取时间为60 min。考察了水浴回流提取和超声两种提取方法，结果表明当提取1 h时，水浴回流比超声提取率高，因此采用回流提取法；考察以30 %甲醇、50 %甲醇、80 %甲醇和纯甲醇作为提取溶剂时各成分的提取率，结果30 %甲醇提取的杂质较多，综合考虑各成分的提取率，选择50 %甲醇作为提取溶剂。

3.3 检测波长的选择

由于11种组分的最大吸收波长各不相同，在试验初期尝试选择不同的吸收波长分别测定各成分的含量，但使用不同波长对仪器的要求较高，普通的紫外检测器无法达到要求或需要不断切换波长。吸收波长在220 nm和各成分的最大吸收波长之间切换时，大多数组分峰面积变化不明显，可满足定量要求；影响较大的阿魏酸、二苯乙烯苷两种组分，选择220 nm和最大吸收波长分别定量测定，结果不同波长下测得的两种组分含量差别不大，即均符合定量要求，最终选择220 nm作为检测波长。

综上，本文建立HPLC法同时测定斑秃丸中11种活性组分含量的方法准确、简便、快捷、实用性强，可为斑秃丸质量标准的提升和完善，及临床用药提供可靠的质量保证。