周向平，许清孝，刘 峰，周 立，张洪波，樊 建，袁志辉

（1. 湖南省烟草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2. 湖南科技学院，湖南 永州 425199；3. 湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425199）

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是烟草花叶病毒属的代表种，也是研究最为广泛的病毒之一。TMV的寄主非常多，可浸染包括30个科的310多种植物[1]。TMV的基因组为单股正链RNA，全长6 395碱基对，共编码4个开放阅读框（ORF），其中外壳蛋白（coat-protein，CP）编码基因在TMV病毒分类中是一个主要的相关基因[2]。TMV在不同植物寄主上有许多不同的株系，我国主要有TMV-U1、TMV-U2、兰花株系、番茄株系、葫芦科株系、车前草株系和豆类株系；烟草上的株系主要有TMVN、TMV-OM、TMVRS、TMV-U1、TMVC、TMV-Vulgare、TMVY[3]。TMV是烟草的主要病原物之一，感染后烟叶产量下降、品质变劣，常造成巨大的经济损失[4-6]，且目前还缺乏有效的防控措施[7]。近年来，随着烟草漂浮育苗技术的普遍应用，由TMV引起的花叶病在烟草上发生严重[8]，对烟叶品质及产量均造成较大影响。同时，永州不同县区气候的差异性及其独特的地理地质特点也导致了烟草花叶病毒的变异频繁，出现了多种症状类型。为了查明永州主要烟区TMV株系的归属，笔者以采自永州不同烟区的病样为材料，通过对TMVCP基因的克隆及序列分析，并与国内外报道的主要株系（或分离物）的同一基因进行比较，研究其病毒株系的归属，以期为TMV的防控及快速检测方法的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试样品供试样品分别于2020年4月27—29日采集自永州市江永县、新田县、宁远县、江华县、蓝山县、道县等不同烟草种植区，采样植株表现出花叶、叶片皱缩、植株矮化等症状。

1.1.2 引物与试剂根据已报道的序列（福建分离物，登录号：AF165190；山西分离物，登录号：JF 920727），设计并合成扩增TMVCP基因部分序列引物（见表1）。植物总RNA 提取试剂盒Transzol购自北京全式金公司，反转录试剂盒和pGEM-T Easy载体购自Promega公司，DNA聚合酶购自TaKaRa，其他试剂为国产分析纯。

表1 TMV CP基因序列扩增引物

1.2 方 法

1.2.1 TMV RNA提取利用Transzol试剂盒提取植物总RNA。提取到的总RNA通过甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA的完整性和DNA污染情况。

1.2.2 RT-PCR反转录TMV RNA参照王莉爽等[9]采用RT-PCR两步法对TMV的CP基因序列进行扩增。

1.2.3 产物克隆及测序RT-PCR扩增产物经DNA回收试剂盒连接到pGEM-T Easy载体，转化到大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。所筛选的阳性克隆送上海华大基因有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析利用DNAStar软件进行序列拼接和分析；以获得CP基因序列为基础，用Mega 7.0程序的邻近连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建TMV病毒CP基因组序列的系统进化树，其各分支的可信度用Bootstrap检测（1 000次重复）[10]。从NCBI数据库中选择15个代表性TMVCP基因序列用于CP基因比较和分析，这15个代表性序列的TMV病毒及其序列登录号为：Fujian（AF395129.1），Africa（AY360447.1），Jimo（HE818443.1），Chongqing（EF183504.1），Fujian-U1（AF165190.1），Henan（GU324660.1），Japan（D63809.1），Korea（X68110.1），Kunming（AF516912.1），Shandong（DQ014551.1），Shanxi（JF920727.1），South Korea（DQ981481.1），USA（NC_001367.1），Vietnam（AM412008.1），Zhejiang（GQ280795.1）。

2 结果与分析

2.1 CP基因扩增结果

经电泳和测序验证，设计的4对引物中，03号引物能获得较好的TMVCP基因扩增结果。故后续的所有样品扩增均采用该引物。

从江永县、新田县、宁远县、江华县、蓝山县、道县6个县区23个乡镇采集的烟草普通花叶病样品91个，经总RNA提取和RT-PCR扩增后进行电泳。结果显示，有83个样品的扩增结果为阳性，阳性率为91.21%（见图1）。扩增阴性的样品主要来自道县和蓝山县，这2个县的普通花叶病发病情况普遍较轻，采集样品难度较大。道县样品的阳性率为80.00%，蓝山县样品的阳性率为78.57%，均低于综合阳性率，这从侧面反应了这2个县的普通花叶病发病与其他病害相混杂的情况较其他县多。另外，由于所采集的样品中混杂有相似症状但不是TMV感染所造成的情况，因此样品的阳性率低属正常现象。

图1 烟草普通花叶病样品TMV扩增电泳结果

2.2 测序结果及分析

扩增产物经DNA回收试剂盒连接到pGEM-T Easy载体，转化到大肠杆菌DH5α，挑选筛选阳性克隆。对所筛选的阳性克隆每个样品随机选取2个送上海华大基因有限公司测序。所得序列与NCBI数据库比对后发现，所有序列均为TMVCP基因。从NCBI数据库中选择代表性TMVCP基因序列，与所有阳性样品序列一起构建系统发育树（见图2）。该系统发育树中，所有获得的TMVCP基因与挑选的15个代表性序列一起分成了2个大枝。其中1大枝仅含有43个CP基因序列，未与NCBI数据库的15个代表性序列中的任何1个聚在一起，且永州烟区6县均有样品分布在其中。这43个样品的BLAST比对结果，序列相似性较低，仅95.6%～97.3%，且变异样品中有65.3%是采自发病率10%以上的烟田。系统发育树中另1大枝则由其他40个CP基因序列和15个代表性序列聚在一起，永州烟区6县均有样品分布在该大枝中。这40个样品序列除日本分离物和我国山东分离物外，美国分离物、越南分离物、非洲分离物、韩国分离物以及我国的山西分离物、河南分离物、重庆分离物、福建分离物和浙江分离物均可以在永州烟区6个县的样品中找到亲缘种。

永州烟区各县的TMV株系虽然混杂，但各县也存在一些主要的分离物亲缘种，如表2所示，TMV亲缘种宁远县以山西和福建分离物为主，还包括云南、韩国、日本和河南分离物；新田县以山东分离物为主，还包括重庆、韩国、浙江、云南、福建分离物；蓝山县以山西分离物为主，另有2个样品与重庆分离物亲缘关系最近；道县以福建和山东分离物为主，另有2个样品分别与重庆和美国分离物亲缘关系最近；江华县以山西和福建分离物为主，还包括重庆、非洲和越南分离物；江永县以福建分离物为主，只有1个样品与山西分离物的亲缘关系最近（表2）。由此可见，永州烟区的TMV主要亲缘种包括山西、福建、山东分离物，其中尤以福建分离物所占比例最大，达到33.3%，其次是山西分离物，所占比例为28.6%。

3 结论与讨论

永州烟区获得的TMVCP基因序列构建系统发育树后分成2大枝。其中1大枝含有43个CP基因序列，且未与代表性序列中的任何1个聚在一起，永州烟区6县均有样品分布在该大枝中，说明永州烟区发病样品中的TMV与现有代表性序列存在一定差异，即均发生了不同程度的变异。43个样品的BLAST比对结果仅95.6%～97.3%的低序列相似性也可以说明部分区域的TMV已经发生了变异。变异样品中有65.3%是采自发病率10%以上的烟田，如道县梅花镇和四马桥镇、江华县大石桥乡和白芒营镇。因此，在永州烟区的普通烟草花叶病毒的防控中，要特别注意高致病力或高传播力变异株的出现。另1大枝含有40个CP基因序列且与代表性序列聚在一起，这40个样品序列，也同样包含永州烟区所有6个县的样品，也就是说，数据库中存在的国内外代表性株系均可以在永州烟区的样品中找到亲缘种，说明永州烟区普通花叶病毒的株系来源混杂。由于永州烟区普通花叶病毒的株系混杂，相互之间的多重杂交重组可以使得病毒进化进程加快，从而更容易产生危害程度高的高致病力或高传播力的株系，因为重组是病毒进化的重要途径之一，可改变病毒致病力[11]，扩大其寄主范围[12-13]。因此，在永州烟区普通花叶病的防控中，应特别注意农事操作的规范性，在转场不同乡镇、不同村组，甚至是不同地块进行农事操作时，应做好清洁消毒工作，避免病毒的传播，特别是避免造成病毒株系进化的加快。