余惠文, 赵志霞, 刘芸琪, 张燕妮, 梁秀月, 柯玲俊, 陆銮眉*

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州363000；2.闽台特色园林植物福建省重点实验室,福建漳州363000）

姜荷花（Curcuma alismatifoliaGagnep.）是姜科、姜黄属植物，是热带球根花卉，在炎热、潮湿和阳光充足的气候条件下生长良好.姜荷花的栽培生理、采后生理和分子育种均有相关研究，朱毅[1]、杜启兰[2]和仇硕等[3]报道了姜荷花栽培技术和种球贮藏方法，叶远俊等[4]研究了姜荷花种子的催芽方法，柯玲俊等[5]研究了姜荷花杂交育种，Li等[6]报道了姜荷花开花相关的基因，在姜荷花抗性[7-10]及作为鲜切花的采后生理[11-12]也有相关研究报道，为姜荷花在国内进一步发展积累了理论基础，但是姜荷花花粉活力及贮藏方面的研究尚未报道.

花粉是植物遗传信息的载体和交流工具，花粉贮藏是保存种质资源最简洁、高效的途径之一[13].研究花粉贮藏并得出其适宜的贮藏条件，有助于解决异地授粉和亲本花期不遇的问题，而花粉活力测定有利于提高杂交育种时的授粉效率，对杂交育种工作的开展具有重要意义.本研究开展了姜荷花花粉发育时期的观察、花粉生活力的测定和贮藏的研究，并筛选出适于姜荷花花粉萌发的条件，研究为姜荷花育种工作提供了理论参考，对姜荷花新品种培育具有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 材料的采集与处理

供试用的姜荷花品种：“白雪公主”“清迈红”“粉佳人”“蝴蝶”“巧克力”“绿色巧克力”“荷兰红”“巨人”“樱桃安娜公主”“紫精灵”“白衣天使”“玉如意”“红唇”“清迈粉”，采于漳州市金銮园艺有限公司温室大棚.收集当天散粉的花粉，测定活力后，装入离心管中分别置于4、-7、-20 ℃下遮光保存.

收集“玉如意”“红唇”“清迈粉”“樱桃安娜公主”“紫精灵”“白衣天使”6个品种次日即将开放的花朵将花药剥离，并于28 ℃的烘箱中烘至散粉，然后将收集的花粉分别置于4、-7、-20 ℃下遮光保存.

1.2 花粉发育时期以及花粉的观察

供试用的姜荷花品种：“白雪公主”“绿色巧克力”“荷兰红”“巨人”“樱桃安娜公主”“紫精灵”“白衣天使”“玉如意”“红唇”“清迈粉”.用解剖针取出姜荷花的花药，将其放在载玻片上，滴适量的醋酸洋红染液，然后用镊子反复碾压，将花药中的花粉碾出，除去残渣，盖上盖玻片，观察花粉发育时期.

将花粉用解剖针均匀地涂抹于载玻片的表面，滴适量的醋酸洋红染液，盖上盖玻片，在显微镜下观察.

1.3 花粉生活力检测

1.3.1 醋酸洋红染色法

运用醋酸洋红染色法定期观察新鲜花粉及在各种贮藏条件下花粉发育情况，并且在显微镜下随机选取10个视野，对有活力的花粉进行计数并计算出其萌发率.

1.3.2 花粉管萌发测定法

配制不同比例浓度（蔗糖、琼脂、硼酸）的培养基（梯度1：0.001%硼酸+5%蔗糖+1%琼脂；梯度2：0.001%硼酸+10%蔗糖+1%琼脂；梯度3：0.001%硼酸+15%蔗糖+1%琼脂），将配好的培养基滴到载玻片上，待其凝固，将待观察的花粉均匀地涂抹到培养基上，然后放到装有湿滤纸的培养皿中，将培养皿置于28 ℃培养箱中进行培养5 h后，观察花粉管的萌发情况.

2 结果

2.1 花苞大小与花粉发育时期关系

花粉的发育时期与花序大小无关，主要与花苞的大小有关.“白雪公主”：花苞在0.8 cm 左右为四分体时期，1.1~1.6 cm时处于单核期；“绿色巧克力”：0.5~0.8 cm时处于四分体时期，花苞长0.9~1.75 cm 时处于单核期；“荷兰红”：0.3~0.55 cm时处于四分体时期，0.85~1.5 cm时处于单核期，见图1（a:二分体、四分体共存时期;b:单核期;c:双核期d,e,f分别是对应时期的花苞）；“巨人”：1.1 cm 时为单核期；“玉如意”：0.7~1 cm 时处于二分体和四分体时期，1.2~1.5cm 多处于单核期，大于1.5 cm 时多处于双核期；“红唇”：0.7~0.9 cm 的处于二分体和四分体共存时期，1~1.5 cm 的大多数是单核期，居中期较多，大于1.6 cm 的是双核期；“清迈粉”：0.7~1 cm大多处于二分体和四分体时期，1.2~1.8 cm，大多数处于单核期，靠边期居多，少数有双核期，大于1.8 cm 的多数为双核期；“樱桃安娜公主”：0.5~1 cm 时，处于单核期；“白衣天使”：大于0.6cm 时，细胞多以单核期存在，1 cm 时开始出现液泡化；“紫精灵”：0.6~0.8 cm 时细胞多数处于二分体四分体共存阶段，在1.2 cm左右时细胞多数处于单核期.

图1 “荷兰红”不同花长及对应花粉发育时期Fig.1 Different flower lengths and corresponding pollen development periods of"Holland Red"

2.2 不同品种姜荷花花粉初始生活力比较

用醋酸洋红染色法对姜荷花花粉初始活力进行测定，测出初始活力最好的品种为“白雪公主”，“荷兰红”“清迈红”“清迈粉”等次之.测出不同品种姜荷花初始活力由大到小分别为：“白雪公主”（99.13%），“荷兰红”（98.3%），“清迈红”（94.6%），“清迈粉”（85.57%），“玉如意”（82.53%），“红唇”（82.27%），“巧克力”（68.52%），“紫精灵”（42%），“樱桃安娜公主”（35），“白衣天使”（31%），“粉佳人”（7.54%），“蝴蝶”（7.09%），“绿色巧克力”（5.2%），“巨人”（2.5%）.

2.3 不同贮藏条件对姜荷花花粉生活力的影响

“白雪公主”花粉在4 ℃条件下，花粉染色随着贮藏时间延长而逐渐变浅，活力逐渐降低；在-20 ℃条件下，随着贮藏时间的延长，花粉染色情况变化不明显，染色较深，活力较好，因此其适宜的贮藏条件是-20 ℃下进行贮藏.“荷兰红”花粉，在4 ℃条件下，贮藏110 d 后仍具有活力，但是活力较低，约25%左右；在-20 ℃条件下，贮藏110 d 后花粉的活力仍具有较高的活力，90%以上，与初始活力相近，因此适宜-20 ℃下贮藏其花粉.“清迈红”在4 ℃条件下，前期花粉染色较深，活力较明显，花粉染色随着贮藏时间延长而逐渐变浅，活力逐渐下降.-20 ℃条件下，随着贮藏时间的延长，“清迈红”花粉染色情况变化不大，染色明显，花粉活力较好，在贮藏120 d 后，其花粉活力为69.7%，-20 ℃较适于其花粉贮藏.“巧克力”在-20 ℃下的密封避光保存效果最好，花粉活力仍保持在较高的状态，120 d 后花粉活力为30%左右.“玉如意”在烘干散粉4 ℃下贮藏230 d，花粉活力为71.62%；烘干散粉-7 ℃下贮藏230 d，花粉活力为78.53%；烘干散粉-20 ℃贮藏230 d，花粉活力为69.24%，“玉如意”花粉适宜的贮藏条件是烘干散粉，-7 ℃保存.“红唇”在烘干散粉4 ℃下贮藏230 d，花粉活力为75.56%；烘干散粉-7 ℃下贮藏230 d 时花粉活力为81.2%；烘干散粉-20 ℃下贮藏230 d，花粉活力为91.07%，“红唇”花粉适宜的贮藏条件是烘干散粉，-20 ℃保存.“清迈粉”在烘干散粉4 ℃下贮藏230 d，花粉活力为72.73%；烘干散粉-7 ℃下贮藏230 d，花粉活力为81.82%；烘干散粉-20 ℃下贮藏230 d，花粉活力为78.92%，见图2（a:烘干散粉，4 ℃保存;b:烘干散粉，-7 ℃保存;c:烘干散粉，-20 ℃保存;d:自然散粉，4 ℃保存;e:自然散粉，-7 ℃保存;f:自然散粉，-20 ℃保存），“清迈粉”花粉最适宜的贮藏条件为烘干散粉，-7 ℃保存.“紫精灵”的花粉活力较低，但是烘干散粉，-20 ℃条件下贮藏的花粉活力较高，在贮藏90 d后，花粉基本就失去了活力.“樱桃安娜公主”“白衣天使”的初始活力在30%左右，相对来说活力较差，贮藏60 d 后花粉活力就低于16%（表1）.“粉佳人”“蝴蝶”“绿色巧克力”“巨人”这4个品种的花粉活力较低，60 d左右基本就完全失活，花粉生活力过低，作为种质资源保存的价值较低，杂交育种挑选亲本时不宜做父本.

图2 不同贮藏条件对“清迈粉”花粉活力的影响(贮藏230 d)Fig.2 Effect of different store environment on the pollen germination of"Chiang Mai Pink"

表1 不同贮藏条件对6个姜荷花品种花粉生活力的影响Tab.1 Pollen viability of 6 Curcuma alismatifolia varieties effected by different storage conditions

续表1

2.4 姜荷花花粉萌发活力检测

“白雪公主”新鲜花粉在5%蔗糖浓度培养基中萌发率为74.33%；在10%蔗糖浓度培养基中花粉萌发率为0.07%；在15%蔗糖浓度培养基中花粉萌发率为0%.“清迈红”花粉在5%蔗糖浓度培养基中萌发率为65.09%；在10%蔗糖浓度培养基中花粉萌发率为7.65%；在15%蔗糖浓度培养基中花粉萌发率为0.07%，见图3（a:蔗糖浓度5%;b:蔗糖浓度10%;c:蔗糖浓度15%）。新鲜的“红唇”和“清迈粉”花粉在5%蔗糖浓度培养基中萌发情况最好，萌发率分别为68.42%和46.67%，得出这四种姜荷花花粉适宜萌发培养基配方0.001%硼酸+5%蔗糖+1%琼脂.“粉佳人”和“蝴蝶”花粉在不同蔗糖浓度下萌发率均低于1.8%，“巧克力”花粉随着蔗糖浓度的升高萌发率呈下降趋势，分别为57.31%、35.84%、9.30%.

图3 “清迈红”新鲜花粉在固体培养基上的萌发情况Fig.3 Germination of"Chiang Mai Red"fresh pollen on solid medium

“玉如意”“樱桃安娜公主”“紫精灵”“白衣天使”“荷兰红”在这三种蔗糖浓度培养基下，萌发率均为0%.经过贮藏后的“红唇”“清迈粉”“玉如意”花粉在0.001%硼酸+5%蔗糖+1%琼脂培养基均未检测到萌发的现象.

3 讨论

花粉活力的研究为杂交育种过程中选配优良品种提供重要依据.花粉活力的检测方法有很多种，本实验采用醋酸洋红法与培养基培养法对姜荷花花粉进行检测，这两种方法虽然精度存在差异，但其测定的结果趋势是一致的.染色法较为快捷，但其结果比较间接[14]，相比之下花粉培养基萌发法测定的结果更接近自然状态下的花粉真实活力，数据更为可靠[15].不同植物所需要花粉离体培养基中的主要成分（蔗糖、硼酸、钙等）的浓度、比例不同，因此筛选姜荷花花粉适宜萌发培养基有利于检测其花粉活力.

姜荷花品种“巨人”“绿色巧克力”“粉佳人”“蝴蝶”的初始活力均在6%以下，多为2%左右，其花粉活力过低，不利于花粉贮藏，在杂交育种中不适合作为杂交父本；品种“清迈粉”“红唇”“玉如意”“巧克力”“白雪公主”“荷兰红”初始活力均在80%以上，具有较大贮藏价值；品种“樱桃安娜公主”“白衣天使”“紫精灵”的初始活力均在40%左右，具有贮藏价值.这一定程度上解释了前期姜荷花杂交授粉成功率较低的原因[5].

本研究中烘干散粉贮藏的活力比自然散粉的活力更好，与前人的研究结果类似，即含水量过多会使花药呼吸旺盛，消耗过多养份，使贮藏寿命降低，而适宜的含水量能使花粉呼吸速率降低，减少养份消耗，使花粉贮藏寿命延长[16].贮藏后的姜荷花在培养基上较难萌发，之后可以尝试将硼酸更换为或者添加低浓度的氯化钙，也可以加入适当的生长调节剂.

随着贮藏时间的延长，姜荷花花粉活力总体呈下降趋势.高温会加强花粉呼吸强度，而低温会降低有机物质的消耗从而延长花粉寿命，因此一般花粉活力随贮藏周期延长而逐渐降低，且在低温条件下花粉活力更好[17-18].姜荷花花粉在-20 ℃条件下避光保存的贮藏效果较好，“荷兰红”“红唇”“白雪公主”分别贮藏100、230、90 d 后活力均保持在90%以上；“清迈红”贮藏90 d 后活力为79.70%，“巧克力”贮藏230 d 后活力在40%以上；“樱桃安娜公主”“白衣天使”“紫精灵”的花粉长时间贮藏后活力过低，贮藏30 d 内活力保持较好.