王婷 吴东芝 武雪

摘要 [目的]基于转录组学分析川芎嗪治疗增生性瘢痕的分子机制。 [方法]获取临床手术的增生性瘢痕组织，利用组织块培养法培养分离瘢痕成纤维细胞，分为对照组和川芎嗪组（10 mg/mL）。采用转录组学测序技术及 GO、KEGG 通路富集分析，研究增生性瘢痕成纤维细胞各基因的表达。 [结果]转录组学分析结果得到川芎嗪参与调控2 783个差异基因，GO及 KEGG 通路富集分析显示以上基因主要富集于DNA复制，细胞周期，类固醇生物合成错配修复，p53信号通路，蛋白质的消化吸收，不饱和脂肪酸的生物合成等通路。[结论]该研究揭示调控成纤维细胞的相关调控蛋白，对阐明川芎嗪防治增生性瘢痕的具体作用机制提供了重要信息。

关键词 川芎嗪;转录组;高通量测序;增生性瘢痕

中图分类号 R 285  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）23-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.036

The Mechanism of Tetramethylpyrazine in Improving Hypertrophic Scar Based on Transcriptomics

WANG Ting1，WU Dong-zhi2，WU Xue2

（1.College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000;2.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000）

Abstract [Objective]The molecular mechanism of tetramethylpyrazine in the treatment of hypertrophic scar was analyzed based on transcriptomics.[Method]Hypertrophic scar tissue from clinical operation was obtained，and scar fibroblasts were cultured and separated by tissue block culture method，and divided into control group and tetramethylpyrazine group （10 mg/mL）.Transcriptome sequencing technology and GO KEGG pathway enrichment analysis were used to study the gene expression of hypertrophic scar fibroblasts.[Result]Transcriptome analysis showed that tetramethylpyrazine was involved in the regulation of 2 783 differential genes，and enrichment analysis of GO and KEGG pathways showed that the above genes were mainly concentrated in DNA replication，cell cycle，steroid biosynthesis mismatch repair，p53 signaling pathway，protein digestion and absorption，unsaturated fatty acid biosynthesis and other pathways.[Conclusion]This study reveals the related regulatory proteins that regulate fibroblasts and provides important information for clarifying the specific mechanism of tetramethylpyrazine in preventing and treating hypertrophic scar.

Key words Tetramethylpyrazine;Transcriptomics;High-throughput sequencing;Hypertrophic scar

基金項目 教育厅专项科研计划项目（18JK0212）。

作者简介 王婷（1996—），女，重庆人，硕士研究生，研究方向：抗结肠癌药物。通信作者，实验师，硕士，从事增生性瘢痕的防治和发生机制研究。

收稿日期 2021-06-01

增生性瘢痕是皮肤烧伤、创伤、手术后最常见的并发症之一，每年新增患者达数百万[1]。作为一种严重的皮肤纤维化疾病，不仅影响美观，危害患者的生理和心理健康，甚至会引起严重的功能障碍，给家庭和社会带来沉重的负担[2]。尽管临床上有多种治疗方案，但因增生性瘢痕的发病率、复发率高及治疗周期长等特点，加之目前缺乏预防瘢痕形成及改善瘢痕的特效药物。因此，增生性瘢痕是临床治疗面临的一大难题，成为国内外学者研究的重点和难点。目前认为增生性瘢痕的形成主要与遗传因素、创面炎症反应、细胞因子的作用、胶原代谢失衡和成纤维细胞的功能失调密切相关[2]。其中，成纤维细胞的作用至关重要。成纤维细胞和由其表型转化而来的肌成纤维细胞直接参与皮肤损伤后创面愈合，是多种细胞因子、炎性反应作用的靶细胞，更是导致胶原代谢失衡和瘢痕形成的关键效应细胞[2-3]。

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是从中药川芎中提取得到的活性单体，研究表明川芎嗪可明显改善心肌、肺和肝纤维化等纤维化疾病[4]。Wu等[5]已经证实了川芎嗪通过调节胶原的表达和细胞的增殖与凋亡，从而抑制瘢痕成纤维细胞纤维化，拮抗瘢痕的增生。鉴于中药复方成分多以及作用的复杂性，川芎嗪拮抗瘢痕成纤维细胞纤维化的其余机制研究尚不明确，有待深入研究。该研究采用转录组测序（RNA-Seq） 技术分析川芎嗪干预瘢痕成纤维细胞的差异表达基因，从转录组学水平进一步揭示调控成纤维细胞的相关调控蛋白，以期阐明川芎嗪防治增生性瘢痕的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 样本 增生性瘢痕组织均来自空军军医大学烧伤与皮肤外科即将接受手术的成年患者（20 ～ 44岁）。在试验前，所有患者均有知情同意书，所有方案均由空军军医大学第一附属西京医院伦理委员会批准。

1.2 瘢痕成纤维细胞的分离与培养

组织块经消毒、清洗，置于0.25% Dispase中，4 ℃消化12 h，分离真皮层，洗涤后剪切成0.1～1.0 mm的组织块，接种于培养瓶中，传至2～4代的成纤维细胞冻存于液氮罐中保存，试验用5～8代细胞。

1.3 分组及给药

将体外培养的瘢痕成纤维细胞接种于培养皿，待细胞80%融合时用无血清培养基孵育12 h后，加入川芎嗪（40 μmol/L）处理24 h后收集细胞样本用于后续检测。

川芎嗪购自上海源业生物科技有限公司，纯度98%。取10 mg TMP溶液称重，溶解于1 mL DMSO中，制成10 mg/mL川芎嗪溶液。

1.4 转录组学检测 收集瘢痕成纤维细胞和川芎嗪处理后的瘢痕成纤维细胞样本，使用RNAprep试剂盒提取细胞中总RNA，用含有寡糖（dT）的小球从总RNA中分离poly mRNA，去除rRNA。采用illumina Hiseq测序平台的双端测序模式对多个样本进行高通量测序，去除单细胞SMARTER建库接头，根据illumina测序数据的低质量分数集中于末端的分布特点，利用Skewer软件对测序数据从3′端动态去除和接头序列片段和低质量片段，利用FastQC软件对预处理数据进行质量控制分析，利用FastQC软件对预处理数据进行质量控制分析以及Q20、Q30碱基比例统计。

1.5 差异基因筛选及分析 利用DESeq2软件对不同样本组之间筛选差异表达的已知基因，满足|log2FC|≥1和P≤0.05差异表达范围，筛选2组之间的差异基因。

1.6 GO 和 KEGG 功能分析和富集分析

针对目的基因集采用TopGO软件进行GO功能分析，GO功能富积分析的方法：将全部基因作为背景列表，目的基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用Fisher精确检验计算代表GO功能集在目的基因列表中是否显著富积的P值，再对P值经Benjamini & Hochberg多重检验纠正后得到FDR。KEGG pathway功能分析是针对这些基因进行KEGG数据库中Pathway的功能注释和归类，KEGG pathway功能富积分析方法与GO功能富积分析类似。

2 结果与分析

2.1 基因表达差异 将对照组与川芎嗪处理组的各基因表达情况进行对比，结果表明，川芎嗪组共致使2 783个基因表达水平存在显著变化，其中使表达水平显著上调的基因有1 285个，显著下调的基因有 1 498 个（P<0.01）。

用 R 语言 ggplots2 软件包绘制差异表达基因的火山图，火山图展示2分组之间基因表达倍数差异和显著性程度（圖1），绿色是相对对照组显著性下调的基因（即P≤0.05，foldchange≥2），红色点则为上调基因。查阅相关文献，得到川芎嗪处理后修复增生性瘢痕密切相关的基因，分别列举了处理组与对照组高表达和低表达的5个基因（表1）。

2.2 GO 富集 Gene Ontology 数据库是用专业术语对基因产物的属性进行定义。GO包括3个本体，用来描述细胞学组分、分子功能和参与的生物学过程（图2）。差异表达基因的GO分析结果显示，这些差异基因分别涉及20条生物学过程，主要影响细胞周期、染色体分离、有丝分裂、核分裂、细胞器裂变、DNA代谢过程、DNA复制等，20条细胞学组分为染色体分离，染色体着丝粒区域等相关组分，20 条分子功能主要涉及单链DNA依赖的ATP酶活性，DNA二级结构结合以及细胞骨架的结构组成成分等。

2.3 KEGG 富集 该研究通过 KEGG pathway 显著性富集分析来筛选对照组和川芎嗪干预组间的差异基因参与的主要生化代谢途径和信号转导途径，以 KEGG pathway 为单位，通过超几何检验，筛选出与整个基因组相比后差异表达基因显著富集的pathway，以Q<0.05 的pathway 定义为各组差异表达基因显著富集的 pathway。从复杂调控网络的角度，找出与增生性瘢痕相关的KEGG 通路，从而提取出相关KEGG 通路中的差异表达基因。KEGG 富集结果见图3，这些差异基因被富集于DNA复制、细胞周期、类固醇生物合成错配修复、p53信号通路、蛋白质的消化吸收、不饱和脂肪酸的生物合成等通路上。

3 讨论

增生性瘢痕是烧伤、创伤等皮肤损伤后的严重并发症之一。瘢痕与正常皮肤相比，表面呈红色，局部增厚变硬，严重影响患者外观并引发功能性障碍，给患者心理、生理带来巨大的困扰[6-7]。增生性瘢痕的主要病理特征包括成纤维细胞过度增殖、毛细血管增生以及细胞外基质过度沉积。其发生的诱因主要有烫伤、烧伤及创伤等皮肤深度损伤，创面愈合时间延长，过度的炎症反应及遗传因素等。因此，抑制成纤维细胞的过度增殖、激活成纤维细胞凋亡、减少基于胶原的ECM沉积对增生性瘢痕治疗至关重要。其中，成纤维细胞被赋予完整的机制，允许ECM的沉积和吸收，在稳态条件下不断更新[8]。

该研究通过转录组学测序技术分析了川芎嗪治疗组与对照组瘢痕成纤维细胞的差异表达基因，随后对差异表达基因进行了GO分析和富集分析。研究结果表明，川芎嗪治疗后增生性瘢痕成纤维细胞的基因发生了明显改变，统计分析有2 783个基因发生明显变化，其中显著上调的基因有1 285个，显著下调的基因有1 498个。研究表明[9]，在疤痕中角蛋白16（keratin 16）数量极少或不存在，该研究发现与对照组相比，川芎嗪处理组中的keratin 16表达明显上调。当keratin 16的表达异常时，病变部位的皮肤屏障功能会受到不同程度的破坏，未受累皮肤的屏障功能也会受到影响，不仅皮肤渗透屏障功能受到影响，还会引起皮肤炎症反应和免疫反应，导致机体受到进一步损害[10]。Meyer等[11]研究表明，角质形成细胞中的成纤维细胞生长因子3型受体（FGFR3）对于小鼠皮肤发育、稳态和伤口修复不可或缺，经川芎嗪处理后的瘢痕成纤维细胞与对照组相比FGFR3表达量上调2.39倍（P≤0.05）。进一步发现FGFR1、FGFR2和FGFR3共同作用，能维持表皮完整性和皮肤稳态。Joannes等[12]研究发现，FGF18可抑制成纤维细胞的细胞生长，结果显示川芎嗪处理组瘢痕成纤维细胞中FGF18与对照组相比上调了1.52倍（P≤0.05）。白细胞介素15（IL-15）为一种细胞生长因子，也可以作为一种化学引诱因子，并具有促炎特性。Teich-Alasia等[13]研究证明，从活跃期增生性瘢痕到缓解期增生性瘢痕的进展是由IL-15的减少而引起的活化浸润性T细胞的活性或被动细胞凋亡的结果。IL-15可富集、激活和防止活跃期增生性瘢痕中激活的T淋巴细胞凋亡，因此抑制IL-15的表达可缓解疤痕角质层增厚。临床前试验证明，抗IL-20RA单克隆抗体[14]具有抑制化学药物（四氯化碳）或机械胆管结扎诱导的小鼠模型中TGF-β产生或ECM成分过度积累的效果，故下调IL-20RA表達可减少ECM积累。

该研究从整体上揭示了差异基因的功能、代谢途径和信号通路，阐明了川芎嗪通过调控成纤维细胞增殖的相关基因表达水平来改善增生性瘢痕，为临床治疗增生性瘢痕提供了新思路。

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