谭菊 武彩红 文潮潮 王萌

摘要 [目的]建立一种更优化的STO细胞冷冻保存方法。[方法]STO細胞传至第3代后，调节其浓度至 2.09×105个/mL，开展冷冻保存试验。Ⅰ组将STO细胞置于4 ℃下平衡，1 h后转入-20 ℃下，12 h后将其转至液氮中保存;Ⅱ组将STO细胞装入已注入250 mL 95%乙醇的降温器后，立即转至-70 ℃下，12 h后再将其转至液氮中保存;Ⅲ组将STO细胞悬液于液氮面上方10 cm处平衡20 min，然后将其缓缓转至液氮中。同时，设Ⅳ组为对照组，即STO细胞不进行冷冻处理。在液氮中保存30 d后进行解冻，以STO细胞的回收率、存活率和生长情况为研究指标，通过MTT法进行STO细胞冻存效果评价。[结果]经冷冻处理后，3种方法STO细胞解冻后回收率和存活率均存在显著差异（P<0.05）。Ⅱ组细胞解冻后细胞回收率低于Ⅰ组、高于Ⅲ组，但细胞存活率最高（84.91%）。与Ⅰ组和Ⅲ组相比，Ⅱ组STO细胞冻存方法不仅能保证冷冻效果，而且可以回收更多的细胞。Ⅱ组STO细胞复苏后生长相对缓慢，但STO细胞经培养后可恢复至冷冻前的生长状态。Ⅰ组和Ⅱ组复苏后STO细胞的增殖速度较快，且增殖率基本相同，而Ⅲ组细胞的增殖速度较慢。[结论]Ⅱ组STO细胞于-70 ℃冰箱中平衡过夜，再转移至液氮中超低温冷冻是较为理想的保存方法。

关键词 STO细胞;冷冻保存;存活率;生长

中图分类号 Q 813  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）23-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.035

Effects of Different Methods on the Cryopreservation of STO Cells

TAN Ju， WU Cai-hong， WEN Chao-chao et al

（Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College，  Taizhou， Jiangsu 225300）

Abstract [Objective]To establish an optimized method for the cryopreservation of STO cells. [Method] After subculture 3 generations， the concentration of STO cells were adjusted to 2.09×105 cells per milliliter， and then the cryopreservation experiment was conducted. STO cells in I group were equalized at 4 ℃， transferred into -20 ℃ after 1 h， and stored in liquid nitrogen after 12 h. STO cells in Ⅱ group were placed in a cooler which had been injected with 250 mL 95% alcohol and then transferred into -70 ℃ immediately， and then transferred to liquid nitrogen for preservation 12 hours later. In Ⅲ group， STO cell suspension was balanced at 10 cm above the liquid nitrogen surface for 20 min， and then it was slowly transferred to liquid nitrogen.  At the same time， Ⅳ group was set as the control group， STO cells were not cryopreserved. After being stored 30 days， STO cells were thawed. The cryopreservation effect of STO cells was evaluated by using MTT method with the recovery rate， survival rate and growth rate as the research indices. [Result] After freezing treatment，  the recovery rate and survival rate of STO cells were significantly different among three different groups （P<0.05）. The recovery rate of STO cells in Ⅱ group was lower than that in I group and higher than that in Ⅲ group， but cell survival rate in Ⅱ group was the highest（84.91%）. Compared with Ⅰ group and Ⅲ group， the method of Ⅱ group could not only ensure the freezing effect， but it could also recover more cells. The growth of STO cells in Ⅱ group was relatively slow after resuscitated， but STO cells in Ⅱ group could return to the growth state before freezing. After resuscitation， the proliferation rate of STO cells in Ⅰ group and Ⅱ group was faster， and the appreciation rate was basically the same， while the proliferation rate of STO cells in Ⅲ group was slower. [Conclusion]The preservation method of group Ⅱ （STO cells were equilibrated overnight in a refrigerator at -70 ℃， and then transferred to  liquid nitrogen for ultra-low temperature freezing） was ideal for the preservation of STO cells.

Key words STO cells;Cryopreservation;Survival rate;Growth

基金项目 江苏农牧科技职业学院大学生创新创业课题（202012-806077Y）。

作者简介 谭菊（1978—），女，江苏句容人，讲师，硕士，从事兽医临床研究。

通信作者，教授，博士，从事动物生殖生物学研究。

收稿日期 2021-07-27

胚胎干细胞（ESC）因其具有自我更新能力和多向分化潜能[1]的特点而具有重要的科学价值和应用前景。ESC的自我更新能力可以有效确保其无限增殖和多向分化潜能[2]。在体外，若ESC要维持自我更新的能力，则必须有饲养层或其他分化抑制物的支持[3]，否则ESC发生分化，其多向分化潜能会消失[4]。其中，饲养层细胞是建立和维持ESC细胞系的必要条件[5]。目前，原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和鼠胚成纤维细胞系（STO）2种细胞最常被用作饲养层细胞。STO是已建成的细胞系，可进行多次传代，便于使用[6]。但是，STO细胞株作为连续细胞系，缺乏遗传稳定性，在连续传代过程中容易发生变异[7]。对遗传相对稳定的未变异STO细胞株进行有效保存是防止STO细胞发生变异的有效方法。

低温保存是生物样本最常用的保存方法[8]。常规慢速冷冻已被广泛应用于细胞保存[9-10]。从理论上看，在超低温（-196 ℃）冷冻状态下细胞的代谢活动几乎完全停止，因此生物技术领域常用该方法长期保存细胞[11]。笔者以STO细胞为研究对象，探索不同冷冻方法对其保存效果的影响，旨在筛选相对稳定、效果好、操作简易可行、经济的饲养层细胞冻存方法。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

小牛血清（NCS，Gibco）、DMEM培养液（Gibco）、磷酸盐缓冲液（PBS，上海生工）、二甲基亚砜（DMSO，Gibco）、台盼蓝（TB，上海生工）、噻唑蓝（MTT，上海生工）、STO 细胞均由江苏农牧科技职业学院实验室冻存。

1.2 主要试剂的配制

1.2.1 STO细胞培养液的配制。

将小牛血清于56 ℃下水浴加热30 min灭活，过滤除菌、分装;将90 mL DMEM培养液和10 mL灭活的小牛血清按9∶1混合，即为含10%小牛血清的DMEM培养液，于4 ℃冰箱中保存，用于STO细胞的培养。

1.2.2 冷冻液的配制。

将二甲基亚砜与STO培养液按1∶9混合，吹打混匀。现配现用。

1.2.3 MTT试剂的配制。

称取一定量的MTT粉溶解于PBS缓冲液（pH 7.4）中，制成5.0 mg/mL的MTT溶液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃下密封避光保存。

1.2.4 台盼蓝染色液的配制。

称取一定量的台盼蓝（TB）粉溶于0.9%氯化钠溶液中，配制成0.4%的台盼蓝试剂，4 ℃下密闭保存。

1.3 主要方法

1.3.1 STO细胞解冻和培养。

将STO细胞冷冻-解冻后，加入含10%小牛血清的DMEM培养液，置于CO2培养箱中培养，直至细胞汇合度为80%左右时加入含10 ng/mL丝裂霉素的DMEM培养液作用2.5 h;将1.75×105个/孔的STO 细胞置于用0.1%明胶预处理30 min的4孔板中，于CO2培养箱中过夜培养，使其贴壁[12-13]。

1.3.2 STO细胞计数和存活率测定。

采用台盼蓝染色方法对冷冻前后的STO细胞进行总细胞计数和存活率测定。TB染色后，死细胞呈蓝绿色，活细胞未着色。

1.3.3 MTT法测定细胞活力。

经冷冻-解冻的STO细胞用DMEM培养液进行重悬，在经明胶预处理的96孔酶标板内加入200 μL重悬液，每孔4×103个，然后置于5% CO2培养箱中;分别培养12、24、48、72、96和120 h后，使用酶联免疫检测仪测定[12]。

1.4 試验设计

STO细胞传代至第3代，调节其浓度至 2.09×105个/mL，开展冷冻保存试验。试验分为4组：Ⅰ～Ⅲ组为冷冻试验组，Ⅰ组将STO细胞在4 ℃下平衡1 h后转入-20 ℃下12 h，然后将其转至液氮中保存;Ⅱ组将STO细胞悬液装入已注入250 mL 95%乙醇的降温器中后，立即转至-70 ℃下12 h，然后将其转至液氮中保存;Ⅲ组将装有STO细胞悬液的安瓿管置于液氮面上方10 cm处平衡20 min，然后将其缓缓沉入液氮中。30 d后，检查冻存效果。Ⅳ组为对照组，STO细胞不进行冷冻处理。

1.5 数据统计与分析

试验数据使用SPSS 19.0统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 STO细胞冻后回收率和存活率

STO细胞在液氮中保存30 d后，于37 ℃解冻后复苏3 min，复苏后的细胞总数及解冻后STO细胞存活率见表1。

由表1可知，经3种冷冻方法处理后，STO细胞解冻后回收率和存活率均存在显著差异（P<0.05）。Ⅱ组STO细胞解冻后回收率低于Ⅰ组、高于Ⅲ组，但细胞存活率最高（84.91%）。这说明Ⅱ组STO细胞冻存方法较Ⅰ组和Ⅲ组冻存方法能更好地保证冷冻效果，且可以回收更多的细胞。

2.2 STO细胞冻后的生长

2.2.1 复苏STO细胞的形态学观察。

与Ⅳ组未经冷冻处理的STO细胞相比，Ⅱ组冻存STO细胞复苏后生长缓慢。Ⅱ组和Ⅳ组STO细胞接种培养结果如图1所示。从图1可以看出，Ⅱ组第0代细胞接种后的前几天培养的STO细胞生长速度较慢;传代接种3 h后Ⅳ组细胞已经有拉长铺展、贴壁的现象，且核膜核仁逐渐清晰（图1A），而Ⅱ组细胞则在培养6 h后开始出现贴壁、细胞分裂的现象（图1D）;Ⅳ组细胞传代接种12 h后50%以上呈典型的纤维细胞形状，而Ⅱ组细胞在接种48 h后才出现此现象;Ⅳ组细胞传代接种5 d后细胞贴壁展开面积占培养瓶底面积的90%以上，而Ⅱ组细胞贴壁展开面积不足培养瓶底面积的60%，且细胞质内可见微小空泡，细胞核周围颗粒化不明显。

2.2.2 冷冻复苏前后STO细胞的生长曲线。

STO细胞经冷冻、复苏后继续培养12、24、48、72、96和120 h进行MTT法测定，根据获得的OD值绘制生长曲线，见图2。由图2可知，冷冻保存30 d后，Ⅰ组和Ⅱ组STO细胞的增殖速度较快，且增殖率基本相同，而Ⅲ组STO细胞的增殖速度较慢。究其原因，一方面，在冷冻过程中低温和冷冻保护剂等因素对细胞有一定的伤害、刺激作用;另一方面，由于Ⅲ组细胞回收率低，复苏后细胞接种密度小，因而影响了细胞生长。

3 讨论

在低温冷冻条件下处于悬浮状态的细胞能长期保存，对人类和动物生殖医学研究、临床应用及种质资源保护均发挥着重要作用[14]。STO 细胞作为饲养层时，可分泌干细胞生长因子，从而发挥维持干细胞多能性的作用，因此STO细胞被广泛应用于人类和动物胚胎干细胞研究[13]。笔者比较了3种不同冷冻方法对STO细胞保存效果的影响，结果表明Ⅱ组STO细胞于-70 ℃冰箱中平衡过夜，再转移至液氮中超低温冷冻是较为理想的保存方法。复苏后，STO细胞虽然在培养前2 d受活力的恢复、生长环境的适应以及接种密度等因素的影响，出现生长相对缓慢的情况，但仍可在2 d内恢复至冷冻前细胞的生长状态。这说明Ⅱ组所用的冷冻方法对于保存STO细胞是有效的。

采用Ⅱ组的冷冻方法保存STO细胞取得了较好的冷冻效果，其原因主要在于Ⅱ组在保存过程中降温过程较I组和Ⅲ组相对稳定。Ⅱ组所用的降温器预先加入250 mL 95%的乙醇，可以延缓降温速度，使降温速度保持在1 ℃/min左右[7]，保护细胞不会因降温速度过快而使胞内水分渗出[15]，避免胞内产生大量冰晶;同时，也不会因为降温速度过慢而促使胞内外形成冰晶。若冷冻时导致胞内有冰晶产生，随着温度的进一步降低，胞内冰晶的体积随之膨胀，会导致细胞骨架损伤和DNA损伤，进而造成细胞死亡;同时，冰晶也会导致细胞内的酶和蛋白质发生改变[15]。当胞外冰晶过多时，则容易引起胞外电解质浓度骤变，从而对细胞造成溶质损伤[16]。-70 ℃的超低温冰箱用途相对简单、控温能力强，可避免因反复开关使用而导致其内温度发生明显改变。另外，Ⅱ组冷冻保存操作步骤相对简单，细胞无需多次转移后再投入液氮中，减少了每次转移过程中由于温度急剧变化而造成的细胞损伤[7]。

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