王 绮，李永玉*，彭彦昆，韩东海，刘亚超

（1 中国农业大学工学院 国家农产品加工技术装备研发分中心 北京100083 2 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083）

活菌饮料具有大量活性乳酸菌，其具有改善肠胃环境，促进肠道吸收，促进肠道蠕动，并且在肠道中制造人体所需的维生素，缓解腹泻等一系列优点，在饮品行业逐渐占据广泛的市场[1-4]。乳酸活菌数是活菌饮料的重要指标。国家标准GB 7101-2015《食品安全国家标准 饮料》中明确规定活菌饮料中活菌数要大于10-6CFU/mL。

国内外乳酸菌的检测方法主要分为传统检测方法和现代分子生物学方法。传统方法为平板计数法，分子生物学方法主要为流式细胞仪法、荧光PCR、阻抗法和TEMPO/TVC 法等。这些检测方法操作复杂费时，所需仪器比较昂贵，而且需要有专业知识的人员操作，还需进行专业培训，不能满足现场快速、实时在线检测需求[5-6]。光谱具有快速、无损、高效等特点，在食品、农业等行业中广泛应用，如在乳及乳制品中的应用也十分广泛[7-9]。岳田利等[10]利用傅里叶变换近红外光谱进行菌落鉴定时，能够定性判别6 种微生物，准确率达100%。赵文静等[11]利用高光谱检测冷藏原料乳的细菌总数，经平滑预处理与降维后，最优模型为Rc、Rp分别为0.9195 和0.8214。马世榜等[12]利用近红外光谱预测牛肉的菌落总数，进而预测生鲜牛肉的储存期。冯东等[13]利用紫外吸收光谱检测酸奶中维生素A 的含量，其平均值的标准偏差为0.32。Pereira 等[14]用近红外光谱测量污染的和不含沙门氏菌的脱脂与全脂牛奶样品，用偏最小二乘法进行判别分析，脱脂乳样品判别模型的RMSEC 为0.1639，RMSEP 为0.0971，而全脂乳判别模型RMSEC 为0.1351，RMSEP 为0.0928。利用近红外光谱可以鉴别牛奶中的沙门氏菌。Triana 等[15]利用原子吸收光谱法和紫外-可见分光光度法分析法测定了27 份市售山羊奶发酵产品、牛奶发酵样品以及9 份添加益生菌菌株发酵乳杆菌D3 的山羊奶发酵产品样品中钙、镁、磷、锌的含量。虽然利用光谱检测菌落总数等的研究不少，但是在乳酸菌的定量分析方面未见报道。活菌饮料中乳酸菌活菌数是重要品质指标，在生产、销售、流通过程中乳酸菌活菌数的无损快速监测具有重要意义。

本文以市售活性饮料为研究对象，基于近红外光谱与紫外吸收光谱进行活菌饮料中乳酸菌活菌数的快速定量检测。探讨不同乳酸菌活菌数饮料样品的傅里叶变换近红外光谱和紫外吸收光谱的吸收峰及其乳酸菌的相关性，确定最合适的光谱预处理方法，建立市售活菌饮料中乳酸菌活菌数的定量预测模型，并对所建立的最优定量模型进行外部验证，旨在利用光学的方法实现乳酸菌活菌数的快速定量检测，为各类食品中乳酸菌定量检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刚上市活菌饮料共145 个样品，购买于北京物美超市。菌种为干酪乳杆菌，活菌含量≥1×108CFU/mL，放置在4 ℃条件下储存。

AntarisTMII FT-NIR 傅里叶近红外分析仪【光谱范围为10 000～4 000 cm-1（1 000～2 500 nm），扫描次数为5 次/s】，赛默飞世尔科技公司；UV759s 型紫外-可见分光光度计【光谱范围190～1 100 nm，带宽1 nm】，上海精密仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 活菌饮料光谱采集

1）近红外光谱数据的采集 预热30 min，采用透反射的方式进行光谱采集。145 个样品每隔2 d 随机选取3 个样品，每次用移液枪吸取190 μL 的样品原液放在1 mm 深的样品池内，光谱扫描次数为32 次，仪器分辨率为4 cm-1，每个样品采集3 次光谱，取平均光谱为最后进行建模分析的光谱，每条光谱共计1 557 个变量。参数增益，以空气为参考对仪器检测条件进行优化。

2）紫外吸收光谱数据的采集 利用紫外-可见分光光度计对样品采集紫外吸收光谱，用生理盐水将样品稀释到10-3梯度，取3.5 mL 稀释样品放入厚度为1 cm 的比色皿中进行采集。光谱数据采集范围为190～500 nm，紫外-可见分光光度计提前预热30 min，采集样品前用生理盐水作为校准的溶液进行基线校准。

1.2.2 活菌饮料中乳酸菌活菌数标准值的测定根据GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中的平板计数法测定样品中乳酸菌活菌数。

2 结果与讨论

2.1 活菌饮料中乳酸菌活菌数标准理化值测定结果

145 个活菌饮料样品每次选取3 个样品每隔2 d 分别采集近红外和紫外光谱，同时利用平板计数法进行了乳酸菌活菌数标准值的测定。活菌饮料中乳酸菌活菌数随着储存时间的延长而减少。将145 个不同储藏期的样品根据马氏距离按3∶1的比例分为校正集与验证集，本次试验中样品乳酸菌数采用菌落数对数值进行表示（见表1）。

表1 活菌饮料中乳酸菌活菌数的统计结果Table 1 The statistical results of the number of live Lactobacillus in live bacteria beverage

2.2 活菌饮料傅里叶变换近红外光谱预处理及分析

利用傅里叶近红外分析仪采集的145 个活菌饮料样品近红外原始光谱曲线如图1a所示。蛋白质是乳酸菌细胞结构的组成成分，而且活菌饮料在长期保存过程中蛋白质与碳水化合物为乳酸菌提供营养物质。蛋白质被乳酸菌的蛋白酶水解成多肽，并进一步被肽酶分解成氨基酸[16]，采集的近红外光谱在4 900～5 204 cm-1范围出现有关蛋白质的吸收峰[17]。同时6 838 cm-1和4 022 cm-1附近出现了脂肪酸和糖类C-H 伸缩振动组合频[18]引起的吸收峰。另外，活菌饮料中主要成分为水，在6 901 cm-1附近出现水的吸收峰，其中6 838 cm-1处和6 901 cm-1处吸收峰非常接近，采集的光谱中2 个特征峰被合并为一个吸收峰。为了消除随机噪声、仪器误差等对样品的影响，需要对原始光谱进行预处理。多元散射校正（MSC）预处理后光谱曲线如图1b所示，MSC 预处理方法主要是对光谱的散射进行校正[19]，使得4 900 cm-1和4 022 cm-1附近的特征峰呈现更好的规律性。SG 平滑与一阶求导（FD）的预处理光谱曲线如图1c所示，FD 预处理获得了原始光谱的形态变换信息[20]，然而并没有将样品之间的差异变得更加明显，反而使得不同样品间相关吸收峰差异变小。经正交信号校正（OSC）预处理之后光谱曲线如图1d所示，OSC预处理后光谱3 个主要特征峰样品间差异更加明显，而且保留了全波段的光谱信息。

图1 活菌饮料傅里叶变换近红外光谱图Fig.1 Fourier transform near infrared spectrum of living bacteria beverage

2.3 活菌饮料紫外吸收光谱预处理及分析

不同乳酸菌数的145 个样品的紫外吸收原始光谱如图2a所示。随着存储时间的增加，活菌饮料中的乳酸菌发酵产生乳酸，酸度逐渐增加，乳酸菌数逐渐减小。所有样品在波长206 nm 附近出现了明显的吸收峰，发现峰值吸光度随样品储存时间的增加而逐渐降低。研究表明，羧基（-COOH）在波长204 nm 附近有吸收峰[21]，由于溶剂的不同会产生一定的偏移，采集的活菌饮料紫外吸收光谱在波长206 nm 处出现了羧基吸收峰。分别对原始吸收光谱进行MSC、SG+FD 与OSC 预处理，结果如图2b～d所示。因活菌饮料样品中存在一些颗粒物，MSC 预处理可以有效消除散射影响，增强了与成分含量相关的光谱吸收信息。与OSC 预处理光谱相比，MSC 预处理校正了基线平移和偏移使其更加紧凑，但是仍有效保留了波长206 nm 处样品间特征吸收峰差异。SG 平滑与FD 预处理虽使光谱中波长206 nm 处的特征峰更加明显，但同时扩大了波长225 nm 处与特征峰无关的光谱信息，影响建模效果。

图2 活菌饮料紫外吸收光谱图Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of living bacteria beverage

2.4 活菌饮料中乳酸菌活菌数定量预测模型的建立

采集145 个饮料样品的傅里叶变换近红外光谱和紫外吸收光谱，并分别进行了MSC、SG+FD和OSC 预处理，其中95 个样品作为校正集50 个样品作为验证集，分别进行了偏最小二乘（PLS）回归分析[22]。

基于傅里叶变换近红外光谱的不同预处理后的活菌饮料中乳酸菌活菌数PLS 建模结果如表2所示。原始光谱以及MSC、SG+FD 和OSC 预处理后的乳酸菌活菌数PLS 定量预测模型均有较好的预测效果。其中OSC 预处理后的乳酸菌活菌数PLS 定量预测模型最优，可能因为OSC 预处理方式能够去掉与样品无关的信息，减小光谱由于外界因素所产生的误差[23]，使3 个主要特征峰样品间差异更加明显，提高光谱峰值与理化标准值的相关性。采用OSC 预处理最优模型校正集与验证集的相关系数分别为0.9878 与0.9565，均方根误差为0.0454 与0.0832。

表2 活菌饮料傅里叶变换近红外光谱的建模结果Table 2 Modeling results of Fourier transform near infrared spectrum of living bacteria beverage

基于紫外吸收光谱的活菌饮料中乳酸菌活菌数PLS 模型分析结果如表3所示。紫外吸收原始光谱的乳酸菌活菌数PLS 定量预测模型结果相比傅里叶近红外光谱模型结果不太理想，然而MSC预处理后消除了样品光谱中粒子散射的影响，校正了基线的平移和偏移，使得模型的预测结果有了显著的提升。采用MSC 预处理最优模型校正集与验证集相关系数分别为0.8705 与0.8229，均方根误差为0.1489 和0.1600。

表3 活菌饮料紫外吸收光谱的建模结果Table 3 Modeling results of ultraviolet absorption spectrum of living bacteria beverage

基于傅里叶变换近红外光谱和紫外吸收光谱的活菌饮料中乳酸菌活菌数定量预测最优模型结果分别如图3所示。活菌饮料中乳酸菌活菌数傅里叶变换近红外光谱定量预测模型结果明显优于紫外吸收光谱的预测模型。这是因为近红外光谱范围更广，所含乳酸菌活菌数的相关信息比较丰富，能够较好的与活菌数之间建立相关性，说明可以基于傅里叶变换近红外光谱对乳酸菌活菌数进行快速检测。

图3 2 种光谱模型的最优结果散点图Fig.3 The optimal result scatter diagram of two spectral models

2.5 傅里叶变换近红外模型的优化

为进一步优化所建模型，本研究利用竞争自适应重加权法（CARS）[24-25]对OSC 预处理之后的傅里叶变换近红外光谱进行特征波长的筛选，CARS 算法中随着MC 采样次数的增加，变量个数、交叉验证均方根误差RMSECV 与每个变量回归系数的变化如图4所示。由图4a 可知，由于指数衰减函数EDF 的作用，前19 次MC 采样中变量个数减小速度非常快，19 次之后变量个数减小速度变得缓慢。RMSECV 随着MC呈现先减小后增大的趋势（图4b），这是因为随着MC 的增加，RMSECV 逐渐减小，大量与乳酸菌活菌数无关的信息或者部分共线的信息被剔除，但是随着MC 的继续增加，RMSECV 开始变大，这是由于光谱中一些与乳酸菌活菌数有关的信息被提出，导致预测测性能变差。RMSECV最小为0.0441，此时蒙特卡洛运行次数为19 次，共筛选出135 个变量为与活菌饮料中乳酸菌活菌数有关的特征波长。

图4 活菌饮料中乳酸菌活菌数特征波长提取图Fig.4 Characteristic wavelength extraction of lactic acid bacteria in live bacteria beverage

利用CARS 算法筛选的135 个特征波长建立乳酸菌活菌数PLS 预测模型，其校正集与验证集的散点图如图5所示。经特征波长筛选后，模型的校正集与验证集的相关系数为0.9974 和0.9837，均方根误差分别为0.0211，0.0508。结果显示，CARS 算法可有效剔除乳酸菌活菌数无关的信息或者部分共线的信息，预测模型效果优于全波段建模结果，提高模型的精度与稳定性，减小运算量。

图5 优化后活菌饮料的模型结果散点图Fig.5 The scatter diagram of the model results of the optimized live bacteria beverage

2.6 活菌饮料中乳酸菌活菌数预测模型外部验证

基于2.5 节所建的活菌饮料中乳酸菌活菌数的傅里叶变换近红外光谱预测模型，预测了与建模样品无关的9 个市售活菌饮料样品的乳酸菌活菌数，同时利用国标法检测9 个样品的乳酸菌活菌数的标准值，并进行了相关性分析。活菌饮料中乳酸菌活菌数的预测值与标准理化值相关系数为0.9068，误差（SEP）为0.0108（图6），说明活菌饮料中乳酸菌活菌数的傅里叶变换近红外光谱预测模型可以对活菌饮料中的乳酸菌活菌数快速定量检测。

图6 模型外部验证结果Fig.6 External model validation results

3 结论

本文以市售活性饮料为研究对象，分别基于近红外光谱与紫外吸收光谱进行了活菌饮料中乳酸菌活菌数的快速定量检测研究。将145 个活菌饮料样品的原始光谱分别进行MSC、OSC 与SG结合FD 预处理，再利用PLS 方法进行乳酸菌活菌数的建模分析。根据结果可以得出采用傅里叶变换近红外光谱建立的模型整体优于紫外吸收光谱所建立的模型，其中傅里叶变换近红外光谱经OSC 预处理方法建立的PLS 模型对于乳酸菌活菌数的预测效果最好，Rc和RMSEC 分别为0.9878，0.0454，Rp与RMSEP 分别是0.9565，0.0832。针对活菌饮料中乳酸菌活菌数的最佳预处理光谱结合CARS 算法进行波长的筛选，获取了135 个预测乳酸菌数的关键变量，有效剔除了光谱中与乳酸菌活菌数无关的信息变量，显著提高了预测模型的精度，Rc与Rp为0.9974，0.9837，RMSEC 与RMSEP 分别为0.0211，0.0508。最后，利用市售未参与建模的9 个样品对傅里叶近红外预测模型进行外部验证，均方根误差为0.0108。结果表明，利用傅里叶变换近红外光谱能够快速准确的预测活菌饮料中乳酸菌活菌数的数量，为活菌饮料的品质检测具有重要意义。