黄徐骏，李海波，陈友吾，叶碧欢，宋其岩，胡传久，沈建军，廖荣俊

（1.遂昌县妙高林业工作中心站，浙江 遂昌 323300；2.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；3.衢州市林业科技推广站，浙江 衢州 324002）

榧树Torreya gr andis隶属于红豆杉科Taxaceae 榧树属Torreya，雌雄异株，为第三纪孑遗植物，分布于长江流域以南地区，包括江苏、浙江、福建、安徽、江西、湖北、湖南、云南、四川和贵州等省[1-3]。香榧T.grandis‘Merrillii’是榧树中的优良变异株经人工选育后嫁接繁殖栽培的珍贵经济树种，具有食用、药用、材用、绿化等多种用途[4-5]。香榧在实生嫁接繁殖中产生了丰富的变异类型，历经多年的优株选育和大批量繁殖试验，浙江省林业育种工作者选育出了多个榧树优良品种。2011 年，良种‘细榧’T.grandis‘Xifei’通过国家林业局林木品种审定委员会审定。近年来，浙江省审（认）定了‘珍珠榧’‘大长榧’‘象牙榧’‘东白珠’‘脆仁榧’‘朱岩榧’‘丁山榧’‘东榧1 号’‘东榧2 号’‘东榧3 号’‘大叶种细榧’‘磐安长榧’‘玉山鱼榧’‘磐大榧’‘磐安长榧’‘玉山鱼榧’等众多新品种[6-9]。此外，在野生榧树资源中，一些植株的种实性状变异显著，如磐东榧、窈川大榧、大圆榧的种实为特大型，中圆榧的种实较大，大丁香的种实形状为卵圆形，磐米榧的种实形状为倒卵形。这些已被用作榧树新品种选育材料，但目前尚未认定的品系在种实性状以及成熟期、种核榧眼数等方面均与‘细榧’有明显差别[10]。随着榧树新品种的不断选育和香榧产业的发展壮大，这些新品种和品系的鉴定与知识产权保护也急需相应的分子技术手段跟进。

榧树品种的鉴别一直是基于传统的形态学上的分类，即根据盛果期榧树果实或种子的性状分为圆籽型（大、中、小圆榧等）和长籽型（细榧、芝麻榧、米榧、茄榧、獠牙榧、旋纹榧等）。这一鉴别方法需要在一年中的果实成熟后才能鉴定选种，无法进行早期鉴别。自2 000 年以来，一些基于PCR 的分子标记技术如RAPD、ISSR和SRAP 技术相继用于香榧的品种分类、遗传变异和居群遗传多样分析[3,7,11-15]。然而，这些分子标记所采用的均为通用型引物，其PCR 扩增图谱不仅复杂、重复性差，且特异性不高，需经过大量的筛选工作，因此并不适合于品种鉴别。

SSR（简单重复序列，或称微卫星序列）具有多态性丰富、操作简单、结果可靠、重复性好等优点，在DNA指纹图谱的构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等方面得到广泛的应用[16]。荧光SSR 标记的开发是基于DNA 测序平台的毛细管电泳检测方法，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。荧光SSR 标记技术成功用于了油茶Camellia o leifera、柑橘Citrussp.、高粱Sorghum bicolor、月季Rosesp.、杨树Populussp.等种和品种鉴别[17-21]。近年来，有基于榧树转录组测序开发SSR 标记的研究报道[22-23]，但尚未进行多态性筛选，或开发的SSR 标记进行了多态性筛选[24]，但并未用于榧树品种（品系）鉴别。

多重PCR（Multiplex PCR）技术是在一个PCR 体系中包含多对引物组合，在一定的浓度配比和反应条件下，可以实现出多个核酸片段同时扩增的反应[25]。利用多重荧光SSR 标记技术可以同时检测出多种基因型，从而解决了在进行大批量、多批次检测时的费时、费力以及成本高的不足。迄今为止，荧光多重SSR 标记技术仅有用于杨梅Myrica rubra果实鉴定和玉蜀黍（玉米）Zea mays自交系检测的报道[26-27]。因此，探索利用多重荧光SSR标记技术开发榧树新品种或优良、特色品种的特征SSR 指纹（基因型），揭示品种间的基因型差异，对于优良品种的高效鉴别与新品种的知识产权保护具有重要意义。但迄今为止，国内外尚无利用多重荧光SSR 标记技术鉴别榧树品种或品系的报道。本研究以9 个榧树品种（品系）作为实验材料，旨在探究利用多重荧光SSR 标记技术高效鉴别榧树品种或品系的可行性，以期为该鉴别技术推广应用到榧树产业界、为榧树新品种DUS（特异性、一致性和稳定性）测试和知识产权保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

用于本研究的9 个榧树品种（品系）材料于2020 年11 月均采自浙江省磐安县。9 个榧树的品种（品系）名、倍性、形态特征及产地情况见表1。其中，‘玉山鱼榧’‘细榧’‘磐安长榧’‘大香榧’‘獠牙榧’和‘磐大榧’为已通过审定良种，大丁香、大圆榧、中圆榧为尚未认定的品系，其名为暂定名。在本实验中，对每个榧树品种（品系）均采集3 株，取每株2 片幼嫩叶片，混合后放置于密封袋，硅胶干燥保存，至完全干燥后提取基因组DNA。

表1 9 个榧树品种（品系）的基本信息Table 1 Nine Cultivars (Strains) of T.grandis for testing

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂包括植物基因组DNA 提取试剂盒（BioTeke，北京）、2×T5 Super PCR Mix（PAGE）（TSINGKE，北京）等。在SSR 正向引物上加注的荧光染料是FAM（蓝）和HEX（绿），SSR 引物由北京擎科新业生物技术有限公司（TSINGKE，北京）合成。用于毛细管电泳检测的内标试剂是Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)、GeneScanTM-500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems）。

主要仪器包括PCR 仪（Life ECO，Bioer，杭州）、DNA 分析仪（96-well plate,ABI 3730 XL Genetic Analyzer,Applied Biosystems,USA）、NanoDrop 2000（Thermo Scientific,USA）等。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA 提取 将每个榧树品种（品系）的6 片经硅胶干燥后的幼嫩叶片混合粉碎，用混合样提取基因组DNA。DNA 提取方法参照植物基因组DNA 提取试剂盒的操作说明，提取后的DNA 测定浓度，并经琼脂糖凝胶电泳检测，于－20℃保存备用。

1.3.2 SSR -PCR 分析 SSR 标记来源于前期对‘细榧’的转录组测序数据筛选。

为筛选多态性SSR 标记的20 L SSR-PCR 扩增体系为：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）10 µL，FAM 荧光标记的SSR 正向和反向引物（10 mol·L-1）各1.5 µL，DNA 模板（20 ng·µL-1）3 µL，加ddH2O 补齐到20 µL；PCR反应条件为：98℃/2 min、98℃/10 s、退火10 s、72℃/10 s，反应持续30 个循环；最后72℃/2 min，4℃下终止反应。不同SSR 标记的退火温度从50℃至60℃进行筛选优化。PCR 扩增产物先用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测条带，对于可用的SSR 标记再进行毛细管电泳检测，分析其在9 个榧树品种（品系）间的多态性。

为建立Tg_U7 和Tg_U734 标记的多重PCR 扩增体系，对4 条SSR 引物的体积配比进行优化，最后确定了25 µL 多重SSR-PCR 扩增体系为：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）12.5 µL，FAM 荧光标记的正向引物Tg_U7F和反向引物Tg_U7R（10 mol·L-1）分别为0.45 µL 和0.5 µL，HEX 荧光标记的正向引物Tg_U734F 和反向引物Tg_U734R（10 mol·L-1）分别为0.5 µL 和0.55 µL，DNA 模板（30 ng·µL-1）3 µL，加ddH2O 补齐到25 µL。PCR反应条件为：98℃/2 min、98℃/10 s、57.8℃/15 s、72℃/15 s，反应持续35 个循环；最后72℃/2 min，4℃下终止反应。

1.3.3 毛细管电泳检测 内标配制方法采用项目组之前对普通油茶SSR 标记鉴别报道的方法[17,28]和多花黄精Polygonatum c yrtonema转录组SSR 标记开发报道的方法[29]。具体实验步骤为：取10 m l H i-Di 和80 µL GeneScanTM-500 LIZ Size Standard 混匀，离心，以每孔10 µL 分装于96 孔内标板，离心。将SSR-PCR 产物电泳，根据电泳胶图做一定稀释（最低可检测标准为0.1 ng·µL-1），离心。取稀释产物0.5 µL 加入到分配好的内标板中，混匀，离心，放入PCR 仪，于96℃变性5 min。20℃下迅速冷冻2 min，离心。置入DNA 分析仪进行毛细管电泳检测。用Data Collection 3.0 软件收集数据。

1.3.4 数据分析 用GeneMapper 4.1 软件对Data Collection 3.0 软件收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500 LIZ S ize Standard 进行比较，直接给出目标SSR 片段的准确数值（bp）。纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X 为该等位变异的数值大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y 为该位点2 个不同等位变异的数值大小。

2 结果与分析

2.1 多态性SSR 标记的筛选

基于对细榧品种转录组测序得到的Unigenes 序列识别SSR 位点。从2 536 条Unigenes 中共找到2 742 个符合条件的SSR 位点。对含3～5 个核苷酸重复类型的SSR 位点的Unigenes 序列设计SSR 引物，以筛选可用于香榧材料鉴别的多态性SSR 标记。对40 对SSR 荧光引物合成后进行PCR 扩增，结果显示其中的15 对没有扩增出任何产物。进一步对25 对SSR 荧光引物的重复扩增显示，其中的16 对引物可稳定扩增出清晰明亮的单一SSR条带。对这16 个SSR 标记的毛细管电泳检测表明Tg_U7 和Tg_U734 是具有稳定多态性的SSR 标记（表2）。

表2 用于榧树品种（品系）鉴别的SSR 标记Table 2 SSR markers used for identification of cultivars of T. grandis

对9 个榧树品种（品系）的Tg_U7 和Tg_U734 标记的基因型进行检测，检测结果见表3。由表3 可知，在9 个榧树品种（品系）中，Tg_U7 可检测出289/295、277/295 和277/289/295 三种基因型，Tg_U734 可检测出192/222、192/216 和192/216/222 三种基因型。单一用Tg_U7 标记，只能鉴别出‘玉山鱼榧’和大丁香，其基因型分别为289/295 和277/289/295；单一用Tg_U734 标记，只能鉴别出大丁香和‘磐大榧’，其基因型分别为192/216/222 和192/216，这表明尽管使用了多态性SSR 标记，但其对一定范围内榧树材料的鉴别能力不高，且需要进行二次PCR 反应。

2.2 基于多重荧光SSR 标记鉴别榧树材料

为提高SSR 荧光标记对榧树品种（品系）的鉴别效率，建立了Tg_U7 和Tg_U734 标记的多重SSR-PCR 扩增体系，通过对反应体系和退火温度的优化，确定了在25 µL 的多重PCR反应体系中，Tg_U7F/Tg_U7R（10 mol·L-1）的体积配比为0.45 µL/0.5 µL，Tg_U734F/Tg_U734R（10 mol·L-1）的体积配比为0.5 µL/0.55 µL；最适退火温度为57.8℃。扩增结果显示，9 个榧树品种（品系）在SSR 位点Tg_U7和Tg_U734 标记分别可扩增出4 种不同的基因型组合，根据特定的基因型组合可一次性鉴别3 个榧树品种（品系），即‘玉山鱼榧’‘磐大榧’和大丁香，其他6 个品种（品系）具有共同的基因型组合，不能鉴别到单一的品种（品系）（图1、表3）。这表明基于多重荧光SSR 标记技术的基因型组合差异可作为榧树品种或品系特异性的SSR 指纹，为榧树材料的鉴别提供了高效便捷的分子技术手段。

图1 Tg_U7 和Tg_U734 引物组合扩增的9 个榧树品种（品系）的基因型Figure 1 Genotypes of 9 cultivars of T.grandis amplified with combinations of Tg_U7 and Tg_U734 primers

表3 9 个榧树品种（品系）的基因型Table 3 Genotypes of 9 cultivars (Strains) of T.grandis

3 讨论

本研究的基本技术思路是多态性SSR 标记的获得和利用SSR 标记高效鉴别榧树品种（品系）。要获得多态性SSR 标记，需要对前期转录组测序数据的SSR 标记进行大量的筛选工作，要高效鉴别榧树品种（品系），需要建立多重荧光SSR-PCR 反应体系。利用上述技术，本研究实现了对3 个榧树品种（品系）‘玉山鱼榧’‘磐大榧’和大丁香的高效鉴别。这一鉴别技术的重要价值在于可以应用到更多的榧树品种（品系）鉴别，以及新品种（品系）的选育工作上。但在实际应用中，大样本量的榧树品种（品系）仅凭有限数量的多态性SSR 标记可能难以鉴别。因此，大量多态性SSR 标记的获得是这一鉴别技术的核心。为此，在后续工作中，扩大浙江省榧树品种（品系）的收集数量，在更大的转录组或基因组数据范围内筛选出在榧树品种（品系）间具有高度多态性的SSR 核心标记（SSR 核心引物），是这一鉴别技术推广应用到榧树产业界的前提条件，也可为榧树新品种DUS（特异性、一致性和稳定性）测试和知识产权保护等方面提供技术支持。

在品种鉴别工作中，最理想的结果是获得某个品种不同于其它品种的唯一性的DNA 指纹。事实上，仅仅一个多态性的SSR 标记往往达不到唯一性这个要求，尤其是品种数量扩大或出现新品种时。利用多态性SSR 标记的组合可有效提高鉴别能力，正如本研究利用Tg_U7 和Tg_U734 组合标记可一次性检测出3 种不同的基因型组合，从而鉴别3 个榧树品种（品系）。通过不同SSR 引物的组合提高引物的鉴别能力在枣Ziziphus j ujuba品种[30]、陆地棉（棉花）Gossypium hirsutum主栽品种[31]和多花黑麦草Lolium multiflorum品种[32]的鉴别中都成功应用。因此，通过多个多态性SSR 标记的组合有效提高鉴别能力，可保证本技术在实际应用中鉴别大样本量的榧树品种（品系）材料。

针对多个多态性SSR 标记的应用，本技术引入了多重荧光PCR 技术。多重荧光PCR 技术体系的建立旨在一个PCR 反应体系中一次性完成鉴别，不仅提高了工作效率，也减少了各种试剂和模板DNA 的用量。在多重荧光PCR 反应体系中的引物可以用不同颜色的基团（FAM、HEX、NED、PET 等）进行修饰，只要扩增片段的大小不重叠，在同一毛细管电泳的泳道中可检测多达20 对以上的扩增片段，从而大幅度提高检测效率[27]。因此，在获得多个SSR 核心标记的基础上，可进一步优化建立多个核心标记组合的多重荧光PCR 反应体系，避免了多个标记需要进行多次PCR 实验，从而实现榧树品种（品系）的高效鉴别。

此外，为获得多个SSR 核心标记，后续对转录组SSR 标记的筛选工作量较大，势必会增加荧光SSR 引物的合成成本，为此可尝试利用TP-M13（Tailed Primer-M13）自动荧光检测法，即将M13 序列作为通用的接头，引入SSR 的荧光测序鉴定中，从而可以大幅度降低SSR 引物的筛选成本[33-34]。

4 结论

基于转录组测序数据筛选出了多态性SSR 标记Tg_U7 和Tg_U734，利用多重荧光PCR 技术将SSR 标记Tg_U7 和Tg_U734 整合，9 个榧树品种（品系）在2 个SSR 位点Tg_U7 和Tg_U734 标记可扩增出4 种不同的基因型组合，分别为289/295 和192/222、277/295 和192/222、277/289/295 和192/216/222 以及277/295 和192/216，可一次性将3 个榧树品种（品系）‘玉山鱼榧’‘磐大榧’和大丁香鉴别出来。本研究表明基于多重荧光SSR标记技术的基因型组合差异可作为品种（品系）特异性的SSR 指纹，为榧树品种（品系）的鉴别提供了高效便捷的分子技术手段。