宋利沙 蒋妮 张占江 陈乾平 冯世鑫

摘要：【目的】明确津岛链霉菌JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用，为三七根腐病的生物防治提供理论依据。【方法】采用平板拮抗和滤纸条法测定津岛链霉菌（Streptomyces tsukiyonensis）菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的的抑制作用，并采用离体块根刺伤接种法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌的防治效果;利用酶联免疫分析（ELISA）法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纖维素酶和几丁质酶等酶活性。【结果】菌株JT-2F对三七根腐病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌率达76.47%，对3种三七叶部病害病原菌也有明显的抑制效果，抑菌率均超过80.00%。菌株JT-2F的发酵液对病原菌菌丝有明显的抑制作用，使菌丝体畸形、膨大变粗，并呈串珠形状。产酶能力测定结果显示，菌株JT-2F可分泌几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶，可破坏病原菌菌丝体，并抑制病原菌生长。离体防效试验结果显示，菌株JT-2F发酵原液对离体三七块根根腐病的防效达78.43%。【结论】津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病菌有较好的抑制作用，具有较好的生防开发潜力。

关键词： 三七;根腐病菌;津岛链霉菌;抑制作用

中图分类号： S435.672                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2133-07

Inhibitory of antagonistic Streptomyces tsukiyonensis JT-2F to Fusarium solani of Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen

SONG Li-sha1， JIANG Ni1*， ZHANG Zhan-jiang1*， CHEN Qian-ping1， FENG Shi-xin1

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning  530023， China）

Abstract：【Objective】The inhibitory effect of Streptomyces tsukiyonensis JT-2F against Fusarium solani of Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen was clarified to provide theoretical basis for biological control of root rot of P. notoginseng. 【Method】The inhibition effect of S. tsukiyonensis JT-2F on F. solani and three P. notoginseng leaf disease pathogens was determined by plate antagonism and filter paper method， and the control effect of JT-2F strain on P. notoginseng root rot was determined by in vitro root tuft injury inoculation method，  enzyme-linked immunoassay （ELISA） was used to determine the activities of protease， cellulase and chitinase in fermentation broth. 【Result】The results showed that JT-2F had a strong antagonistic effect on F. solani， and its inhibition rate reached 76.47%. The control effect of strain JT-2F on three JT-2F strains fermentation broth had obvious inhibitory effect on the pathogenic mycelium， which made the mycelium deformed， enlarged and thickened， and in a string ofbeads shape.JT-2F strain could secrete protease， cellulase and chitinase to destroy the mycelia and inhibit the growth of the pathogen. In vitro control effect test showed that JT-2F fermentation broth showed 78.43% control effect of in vitro P. notoginseng root rot. 【Conclusion】S. tsukiyonensis JT-2F strain can inhibit the growth of F. solani of P. notoginseng， and has potential in bio-control development.

Key words： Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen;Fusarium solani; Streptomyces tsukiyonensis;inhibiting effect

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation Joint Funding Cultivation Project（2019GXNSFAA245040）; The Fund for Local Science and Technology Development Guided by the Chinese Government（Guike ZY20198010）; Youth Science Fundation of Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants（Guiyaoji 201801）; Guangxi Botanical Garden Science and Technology Innovation Team Project （2019007）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen]为五加科人参属多年生植物，是我国特有的大品种中药材，主要分布于广西和云南等地，具有散瘀止血、消肿定痛、降血脂等功效（国家药典委员会，2020）。目前，根腐病是三七种植面临的重要问题，主要集中在由镰孢属真菌（Fusarium spp.）引起的根腐病（董鲜等，2018;张晋豪等，2020），其发病原因复杂，防治难度较大。当前三七根腐病的防治以化学药剂为主，但长期使用化学农药易使病菌产生抗、耐药性（丁中等，2001;张明亮等，2019），使防治效果下降，甚至对环境造成污染，产生的农药残留也严重影响中药材的质量安全，危害人类健康。相比于化学防治技术，微生物防治植物病害因具有高效、安全、环保的优点，已逐渐成为植物病害防治的重要方法之一，是目前国内外研究重点，也是未来有机中药材生态种植的发展趋势。【前人研究进展】放线菌由于能产生大量结构多样的具有抗菌活性的抗生素，且存在于不同类型的土壤和水中，菌种资源更丰富，因而在生物防治的应用中更为广泛和有效（Lee and Hwang，2002;Jung et al.，2018）。目前，放线菌用于防治作物病害的研究已有较多报道。宗兆锋等（2002）研究发现，从番茄叶片上分离获得的放线菌对7种病原真菌（大丽轮枝菌、扩展青霉菌、胶孢炭疽病菌、灰葡萄孢菌、褐孢霉菌、粉红聚端孢菌和梨状毛霉菌）具有不同程度的抑制效果;董美玉等（2008）研究表明，从土壤中分离到的放线菌ZY105对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率达85%;申哲等（2008）和涂璇等（2008）研究发现，淡紫灰链霉菌对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌及黄瓜炭疽病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用;刘琴等（2020）研究表明，使用娄彻氏链霉菌SR-1102的100倍液灌根对番茄枯萎病的防治效果达72. 84%;牛红杰等（2020）从黄瓜根际土壤分离得到1株小链霉菌，该菌对黄瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌）具有一定的抑制作用;汤曼利（2020）研究表明，海洋放线菌梅久兰链霉菌F28对海洋细菌副溶血弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，并对其他8种病原菌具有广谱抑菌活性。放线菌对中药材根腐病抑制作用的研究有少量报道，强薇等（2014）研究发现，从人参根际土壤中筛选出的7株放线菌对人参根腐病的拮抗率达65.11%;杜用玺等（2020）研究表明，3株放线菌及其发酵液对丹参根腐病病原菌具有一定的抑制作用，其抑制率超过60%。【本研究切入点】本课题组前期研究发现1株放线菌津岛链霉菌（Streptomyces tsukiyonensis）JT-2F对三七根腐病菌具有很强的拮抗作用（Song et al.，2020），但尚未就该菌对三七根腐病菌的抑制作用开展研究。【拟解决的关键问题】采用平板拮抗和滤纸条法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌和3种三七叶部病害病原菌的抑制作用，初步研究菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌的抑制作用，评价其对三七根腐病菌的抑制效果;在光学显微镜下观察菌株JT-2F对三七根腐病菌抑制作用的影响;利用酶联免疫分析（ELISA）法测定菌株JT-2F发酵液中蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶活性，以验证菌株JT-2F对三七根腐病菌的抑制作用;进一步开展离体块根防效研究，从表观上证明津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病的防治作用，为三七根腐病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试菌株 供试三七叶部病害病原菌包括三七灰霉病菌（Botrytis cinerea）、三七黑斑病菌（Alternaria panax）和三七炭疽病菌（Colltetorrichum gloeosporioides），根部病害病原菌为三七根腐病菌（F. solani），均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。供试津岛链霉菌JT-2F为广西药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，菌株登录号MK368447。

1. 1. 2 培养基 采用高氏一号培养基培养放线菌。参考仇艳肖（2010）的方法，分别制备含几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白的培养基，以检测菌株是否具有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性。几丁质培养基：胶体几丁质5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO4 0.3 g，K2HPO4 0.7 g，ZnSO4 0.001 g，琼脂20.0 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。羧甲基纤维素钠（CMC）培养基：CMC-Na 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2SO4 0.5 g，K2HPO4 0.25 g，琼脂20.0 g，H2O 1000 mL。酪蛋白培养基：取5.0 g脱脂奶粉加入到50 mL蒸馏水中，另称1.5 g琼脂溶于50 mL蒸馏水，将2种溶液分开灭菌，待冷至45～50 ℃时，将2种溶液混匀倒平板，即成牛奶平板。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株JT-2F对三七根腐病菌及其叶部病害病原菌的抑制作用测定 采用平板对峙法测定菌株JT-2F对三七根腐病菌及其叶部病害病原菌的抑菌效果，采用滤纸条法复筛（张瑾等，2014）。平板对峙法：将直径为0.5 cm的病原菌组织块置入PDA培养基中心，在其两侧等距离处接种菌株JT-2F组织块，以只接种病原菌为对照，每处理3个重复;待对照长满整个平皿时，测量菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。滤纸条法：对菌株JT-2F进行发酵，取直径为5 mm的3个菌饼接种于装有高氏一号液体培养基（100 mL）的三角瓶（250 mL）中，于28 ℃下180 r/min摇床培养3 d，制备种子液，然后按10%的接种量接种于装有100 mL液体培养基的三角瓶中，在28 ℃下180 r/min摇床培养7 d后，于10000 r/min离心15 min，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，制得上清液为无菌发酵液;在PDA培养基中心接种三七根腐病菌菌饼，在菌饼两侧等距离放置经发酵液浸没过的无菌滤纸条，以无菌水作对照，3次重复;抑制率计算参照平板对峙法。

1. 2. 2 菌株JT-2F发酵液对致病菌的拮抗作用测定

发酵液的制备方法参考1.2.1滤纸条法。采用含毒介质法测定发酵液对病原菌的抑制作用。取适当比例发酵液与50 ℃左右的PDA培养基混匀，倒平板，用于拮抗病原菌试验。用镊子挑取三七根腐病菌和处理菌株菌落的菌丝，制玻片。在光学显微镜下分别观察处理菌株和对照菌株菌丝体的形态特征，并拍照统计。

1. 2. 3 菌株JT-2F产酶能力测定 参照仇艳肖（2010）、刘洋等（2016）的方法进行菌株JT-2F产酶能力初筛。挑取菌株JT-2F菌块分别置于几丁质、羧甲基纤维素钠和酪蛋白培养基上，观察有无透明圈产生，若产生透明圈，则表明有几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶产生;采用酶联免疫分析法测定产酶菌株制得的发酵液中各种酶活性（宋利沙等，2019）;用酶标仪在450 nm波长处测定不同酶活的吸光度（OD），通过标准曲线计算样品中待测指标的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度或酶活。

1. 2. 4 菌株JT-2F对三七根腐病菌的离体防效试验

采用刺伤接种法（方中达，1998）测定菌株JT-2F对离体三七块根根腐病菌的防效。选取大小一致的3年生三七块根，先用自来水冲洗干净，75%酒精表面消毒后无菌水冲洗、晾干，置于超净工作台用无菌接种针在块根上刺1个直径为6 mm的圆形接种面，将拮抗菌株的发酵滤液原液和稀释液（分别稀释10、20、50、100和200倍）分别涂抹在伤口处，然后在伤口处接种三七根腐病菌菌饼（直径7 mm），对照涂抹无菌水，每处理3次重复，5 d后测量并记录病斑面积，计算防效。病斑面积和防效计算公式参考薛应钰等（2020）。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 22.0计算平均值和标准差，并进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 菌株JT-2F对三七根腐病菌的拮抗作用

从图1和图2可看出，菌株JT-2F对三七根腐病菌有明显的抑制作用，抑菌率达76.47%（表1）。菌株JT-2F对三七叶部病害病原菌也有明显的抑制效果，抑菌率均超过80.00%，其中对三七黑斑病菌的抑制率达87.06%，显著高于对其他三七病害病原菌的抑菌率（P<0.05，下同）（表1），表明菌株JT-2F具有广谱抑菌性。

2. 2 菌株JT-2F发酵液对三七根腐病菌菌丝的抑制作用

在光学显微镜下，观察到受菌株JT-2F影响的三七根腐病菌菌丝生长畸形，菌丝膨大变粗，呈串珠形状，而正常菌丝光滑、细直（图3），表明菌株JT-2F发酵液对病原菌菌丝的抑制作用明显。

2. 3 菌株JT-2F产酶能力测定结果

菌株JT-2F的产酶能力测定结果见图4。图4-A～图4-C均有明显的水解圈，表明菌株JT-2F分别能产生和分解培养基成分的3种酶，包括几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶;取该菌株的无菌发酵液测定3种酶的活性，结果显示，几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶的活性分别为177.49、89.01和444.92 U/L。说明菌株JT-2F能产生纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶等水解酶。

2. 4 菌株JT-2F对三七根腐病菌的离体防效测定结果

菌株JT-2F对三七根腐病菌的离体防效测定结果（表2和图5）表明，随着发酵液稀释倍数的增加防效相应降低，其中，发酵原液的防效最高，达78.43%，显著高于其他液稀释倍数处理，当发酵液稀释至50倍时防效降至55.10%，稀释至100和200倍时防效分别下降至30.83%和26.29%，防治效果不理想。

3 討论

链霉菌能产生多种抗生素，广泛应用于农业、工业和医疗卫生行业，在植物病害生物防治方面也发挥着重要作用（薛应钰等，2020）。本课题组前期从肿节风健康植株的根际土壤中分离得到1株链霉菌，经形态学和分子生物学鉴定为津岛链霉菌（Song et al.，2020），该菌对三七根腐病菌及其他三七叶部病害病原菌均具有较好的抑制作用。申哲等（2008）、涂璇等（2008）、颜霞等（2020）研究表明，淡紫灰链霉菌（S. lavendulae）gCLA4对番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米弯孢病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麦纹枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、苹果树腐烂病菌及猕猴桃溃疡病菌等多种植物病原菌均有很好的拮抗作用，具有较好的生防开发价值;胡梦君等（2020）研究发现，放线菌菌株1331的10%和20%发酵稀释液对南方根结线虫2龄幼虫48 h的校正死亡率分别达88.97%和100.00%，可有效抑杀南方根结线虫，具有潜在生防价值;雷艳娟等（2020）从13种荒漠植物中分离出533株内生放线菌，其中有74株链霉菌对尖孢镰刀菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等6种靶标菌具有较好的抗菌活性;钱瑶等（2020）研究发现，链霉菌IMS002的发酵液及其产生的化合物Borrelidin对尖孢镰刀菌具有良好的抑菌效果和抑制活性;孙洪宝等（2020）研究发现，生防链霉菌A02对西瓜枯萎病的防治效果达68.23%，且接种链霉菌A02可增加西瓜幼苗株高、茎粗、鲜重和干重。本研究结果表明，津岛链霉菌菌株JT-2F对药用植物三七根腐病具有良好的抑制作用和离体防效，但菌株JT-2F对三七根腐病菌的抗病分子机制、对其他种类三七根腐病病原菌抑菌效果，以及是否能促进植物生长发育等还需进一步探究。

放线菌能产生丰富的次生代谢产物，常能通过液体发酵产生拮抗活性物质来诱导对植物病害的抗性。本研究中菌株JT-2F液体发酵原液使三七根腐病菌菌丝生长畸形，菌丝膨大变粗，呈串珠形状，表明产生了抗生类物质。此外，菌株JT-2F产酶能力测定结果显示均有透明的水解圈，表明菌株JT-2F能分泌几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶等水解酶。据文献报道，菌株产生水解酶可破坏致病真菌的细胞壁，使其菌丝体结构溶解死亡，从而达到防病的作用（仇艳肖，2010）。杜用玺等（2020）研究发现，生防链霉菌属zyzx-001菌株及其发酵液均可对丹参根腐病病原菌产生较强的抑制作用;郭景红等（2020）研究表明，玫瑰黄链霉菌（Strempomyces roseoflavus）的代谢产物对多种重要的植物病原菌均具有较强的抑制作用，从发酵液提取诱抗粗蛋白，发现其可诱导黄瓜叶片中活性氧（ROS）的积累和多种氧化酶（过氧化物酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶）等抗病相关酶活性的显著提高，通过实时荧光定量PCR测定，发现诱抗粗蛋白还可诱导黄瓜叶片中PR-1a、PR-3、PR-9和NPR1等抗病相关基因上调表达;甄丹妹等（2020）研究发现，玫瑰黄链霉菌菌株活性代谢产物可诱导黄瓜产生抗病性的信号转导。本研究进行了菌株JT-2F发酵液对三七根腐病离体防效试验及其产生细胞壁水解酶的初步研究，后续尚需在盆栽和田间等复杂环境中验证链霉菌的生防效果，有关菌株JT-2F对病原真菌细胞壁破坏和菌丝体溶解机制等也有待深入研究。

4 结论

津岛链霉菌菌株JT-2F对三七根腐病菌有较好的抑制作用，发酵原液对离体三七块根根腐病具有良好的防治效果，并能产生多种抗菌活性物质，具有较好的生防开发潜力。

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（责任编辑 麻小燕）

收稿日期：2020-12-28

基金项目：广西自然科学基金联合资助培育项目（2019GXNSFAA245040）;中央引导地方科技发展专项（桂科ZY20198010）;广西药用植物园青年基金项目（桂药基201801）;广西药用植物园科技创新团队项目（2019007）

通讯作者：蒋妮（1979-），https：//orcid.org/0000-0001-8319-4338，副研究员，主要从事中药材病虫害防治研究工作，E-mail：jiangni292@126.com;张占江（1976-），https：//orcid.org/0000-0002-0497-529X，博士，副研究员，主要从事药用植物高质量栽培繁育工作，E-mail： zzj1811@163.com

第一作者：宋利沙（1987-），https：//orcid.org/0000-0002-4502-0879，博士，主要从事中药材病虫害防治研究工作，E-mail：lishasong@126.com