张惠贤，崔文文，王明锐，姚晶晶，杜金平，孙 静，张 昊

（湖北省农业科学院，a.农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室/农产品营养品质与安全湖北省重点实验室；b.畜牧兽医研究所，武汉430064）

皮蛋，又称松花蛋、变蛋、彩蛋等，是中国传统风味蛋制品之一，具有营养丰富、色泽美观、风味独特、食用方便等优点［1，2］。在皮蛋腌制过程中，为了调控氢氧化钠进入量，需要在腌制液中添加一些重金属盐以达到“堵孔”的目的，控制皮蛋的品质［3］。传统的皮蛋加工工艺一般使用氧化铅［4］，但是铅会对人体健康造成危害，尤其会危害儿童的智力发育［5］。近年来，铜、铁、锌等重金属被用来代替铅［6，7］，“铜法”是实际工业化生产中应用最普遍的皮蛋生产无铅化技术［8］。

铜是人体所必需元素之一，但是由于中国人群的特殊膳食结构，普遍不缺铜，皮蛋中过量的铜可能会导致“铜中毒”现象［9］，因此需要实时监控生产过程中腌制液中铜离子浓度，防止皮蛋中铜含量过多。皮蛋腌制液的配料主要组成为氢氧化钠、氧化钙、重金属盐、茶叶等［7］，基质成分复杂，盐度和碱度高，对腌制液中Cu（Ⅱ）的快速、实时检测非常困难，目前还未见文献报道皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）检测的方法。

目前，文献报道了多种食品和环境中Cu（Ⅱ）的检测方法，如分光光度法［10］、电化学分析法［11］、原子吸收光谱法［12］、电感耦合等离子体法［13］、电感耦合等离子体质谱法等［14］。其中，原子吸收光谱法、电感耦合等离子体法和电感耦合等离子体质谱法前处理繁琐耗时、仪器昂贵，不适合Cu（Ⅱ）的快速检测；电化学分析法不适合基质复杂体系［15］。相比于其他方法，分光光度法具有成本低、快速、准确、操作简便等特点，被广泛用于废水、食品、矿物等样品中的Cu（Ⅱ）的检测［16-19］。显色试剂双环己酮草酰二腙（BCO）可以与Cu（Ⅱ）发生显色反应生成稳定的蓝色络合物Cu（BCO）2［19］。因此，本研究以BCO为络合试剂，运用分光光度法检测皮蛋腌制液中的Cu（Ⅱ），实现复杂基质、高盐体系中高含量Cu（Ⅱ）的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器DU800型紫外-可见分光光度计（美国Backman公司）；ME104型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；PHS-3C型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）。

1.1.2 试剂双环己酮草酰二腙（BCO）、硫酸铜、氨水、氯化铵、盐酸、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠（SDS）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；所用水为去离子水。

BCO（DMF/乙醇=v/v∶1/1）溶液（6.0 g/L）的配制：称取0.3 g（精确至0.000 1 g）BCO，加入DMF/乙醇（v/v∶1/1）溶液加热溶解，冷却至室温后，定容至50 mL。

Cu（Ⅱ）储备液（0.8 g/L）的配制：根据皮蛋腌制过程中使用硫酸铜的量，称取0.3 g（精确至0.000 1 g）五水硫酸铜，利用不含硫酸铜的皮蛋腌制液溶解，定容至100 mL。

Cu（Ⅱ）工作溶液配置（16 mg/L）：准确移取储备液1.00 mL，缓冲溶液定容至50 mL。

硼酸-硼砂、柠檬酸-氨水、硼酸-氢氧化钠、氯化铵-氨水缓冲溶液在酸度计上混合至所需pH。

1.2 腌制液中铜离子络合方法

由于皮蛋腌制液成分复杂，Cu（Ⅱ）可能会发生复杂的络合反应，在加入络合试剂BCO前，加入盐酸破坏Cu（Ⅱ）的基底络合态，释放出Cu（Ⅱ）。准确移取2.0 mL皮蛋腌制液，加入2.0 mL 5.0 mol/L HCl溶液，振荡均匀，放置20 min后，利用pH 9.0氯化铵-氨水缓冲溶液定容至100 mL。于25 mL比色管中，依次加入2.0 mL 6.0 g/L BCO储备液、3.0 mL皮蛋腌制液稀释液，用pH 9.0氯化铵-氨水缓冲溶液定容至25 mL后，涡旋摇匀，于30℃络合反应40 min。

1.3 皮蛋腌制液中硫酸铜含量的测定

移取显色溶液于1 cm比色皿中，以相应的参比溶液为参比，于分光光度计606 nm处测量吸光度，从校准曲线上查出相应的Cu（Ⅱ）的含量，按式（1）计算硫酸铜的质量分数。

式中，M(CuSO4)为皮蛋腌制液中硫酸铜的浓度，g/L；m为从校准曲线上查得的样品显色液中的Cu（Ⅱ）浓度，mg/L。

1.4 标准曲线的绘制

25 mL比色管中分别加入2 mL的6.0 g/L BCO溶液，加入不同量的Cu（Ⅱ）标准溶液，氯化铵-氨水缓冲溶液定容至25 mL，使其浓度分别为0、0.32、0.64、1.28、1.92和2.56 mg/L，反应完毕后分别测定其吸光度。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的选择

将络合物Cu（BCO）2及空白皮蛋腌制液的吸收波长进行扫描，结果如图1所示。络合物Cu（BCO）2的最大吸收波长在606 nm处（a），皮蛋腌制液（b）和BCO（c）溶液基本无吸收。结果表明，BCO检测皮蛋腌制液中的铜离子具有可行性，选择检测波长为606 nm，样品基质及BCO在此波长下无干扰。

图1 络合物Cu（BCO）2（a）、皮蛋腌制液（b）和BCO（c）的吸收波长

2.2 络合反应条件研究

2.2.1 缓冲体系及pH的选择选取硼酸-硼砂、柠檬酸-氨水、硼酸-氢氧化钠和氯化铵-氨水4种缓冲体系，根据缓冲溶液的缓冲范围选取pH。如图2A所示，络合反应在硼酸-硼砂和硼酸-氢氧化钠缓冲体系受pH影响较大，而在氯化铵-氨水缓冲体系的pH 8.0~10.0吸光度稳定，在柠檬酸-氨水缓冲体系的pH 9.0~10.0吸光度稳定，但吸光度低于氯化铵-氨水缓冲体系。故选择氯化铵-氨水缓冲体系，络合物Cu（BCO）2在pH 8.0~10.0吸光度是稳定的，为减少pH变化带来的影响，选择pH 9.0的氯化铵-氨水缓冲体系。

2.2.2 缓冲盐用量分别考察了pH 9.0的氯化铵-氨水缓冲溶液（0.2 mol/L氯化铵-1.0 mol/L氨水）不同用量对BCO络合Cu（Ⅱ）的影响，结果如图2B所示。缓冲溶液用量对络合反应无明显影响，说明在该pH下，络合物Cu（BCO）2较为稳定，为减少皮蛋腌制液对反应溶液pH的影响，采用pH 9.0的氯化铵-氨水缓冲溶液定容。

图2 不同缓冲体系及pH（A）及缓冲盐用量（B）对BCO络合Cu（Ⅱ）的影响

2.2.3 反应温度与反应时间络合反应的效率与时间和温度密切相关，图3A是反应温度和时间对BCO络合Cu（Ⅱ）的影响，结果表明，反应温度为30℃时，在40 min时吸光度最大，同时反应时间80 min时，吸光度仅下降了7.4%，表明络合物Cu（BCO）2在该温度下较为稳定。故选择反应温度为30℃，反应时间为40 min。

2.2.4 BCO用量影响根据实际皮蛋腌制液硫酸铜使用的最大浓度3.0 g/L，设置Cu（Ⅱ）浓度为1.2 mg/L，加入不同量的BCO 6.0 g/L（DMF/乙醇=1/1）溶液，使其浓度分别为0.048、0.096、0.144、0.192、0.240、0.300 g/L，考察BCO用量对显色的影响。结果（图3B）表明，当BCO的用量是Cu（Ⅱ）40倍以上时，其用量对显色反应基本无影响，故选择BCO用量为0.048 g/L。

图3 反应时间和温度（A，a：30℃；b：40℃；c：50℃）和BCO用量（B）对BCO络合Cu（Ⅱ）的影响

2.2.5 离子掩蔽剂的影响铁离子、铝离子等元素会干扰Cu（Ⅱ）的测定，选择加入柠檬酸三铵掩蔽铁离子、铝离子等离子的干扰，考察了柠檬酸三铵对络合反应的影响。结果表明，由于皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）浓度远远大于干扰离子浓度，因此离子掩蔽剂对络合反应影响不大。

2.3 体系稳定性

显色剂及其络合物的稳定性对样品检测非常重要，考察了Cu（BCO）2络合物在150 min内的稳定性。如图4所示，络合物在室温150 min内基本稳定，150 min时吸光度只下降约3.0%，对检测无影响，满足检测要求。

图4 室温下络合物Cu（BCO）2的稳定性

2.4 工作曲线、回收率及精密度

在最佳络合条件下，考察了该方法的线性范围、检测限和重现性。吸光度与Cu（Ⅱ）的浓度在0~2.56 mg/L范围内呈线性关系，线性方程为y=0.067 71x-0.011 57，其中，y为吸光度，x为Cu（Ⅱ）的浓度（mg/L），相关系数R2为0.999 5。

分别在不含Cu（Ⅱ）离子的皮蛋腌制液中添加硫酸铜，使其Cu（Ⅱ）最终浓度分别为0.12、0.24、0.48、0.72 g/L，按照最优的络合反应条件进行络合反应计算加标回收率，结果见表1。皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的加标回收率在97.9%~103.4%，日内、日间标准偏差（RSD）低于3.17%，表明该方法具有良好的准确度和精密度。

表1 皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的添加回收率和日内日间精密度（n=5）

2.5 实际样品测定

抽取皮蛋加工厂的不同时期的皮蛋腌制液，根据优化好络合反应条件测得其中Cu（Ⅱ）的含量，再根据式（1）计算其中硫酸铜的含量分别为2.78、1.23、2.07和1.01 g/L。

3 结论

本研究首次将双环己酮草酰二腙（BCO）用于分光光度测定皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ），BCO与Cu（Ⅱ）的络合物Cu（BCO）2最大收波长为606 nm，BCO及皮蛋腌制液在此波长下无吸收，极大地降低了来自皮蛋腌制液基底的背景干扰，使样品前处理更为简单。建立的皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）检测方法具有方便、快速、直接、灵敏、省时和抗干扰能力强等优点。最后，将该方法用于皮蛋腌制液硫酸铜含量的准确测定，为皮蛋生产过程中硫酸铜含量的监测提供有力工具。