刘 威，袁芳艳，周丹娜，刘泽文，高 婷，郭 锐，杨克礼，段正赢，梁 婉，田永祥

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部兽用药物与诊断技术湖北科学观测实验站，武汉430064）

羊流产嗜性衣原体（Chlamydia abortus）为专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，是一种重要的人畜共患传染病病原，属于衣原体科（Chlamydiaceae）衣原体属（Chlamydia），能引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、产弱仔等［1］。流产衣原体为世界动物卫生组织（Office international desépizooties，OIE）规定的二类动物疾病，该病广泛分布于世界各地［2］，对畜牧业造成巨大的经济损失，孕妇感染也可发生流产［3］，其诊断和防治制剂的研究具有十分重要的公共卫生及经济意义［4］。

流产衣原体主要寄生于牛、羊、猪等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞内［5］。不同年龄段的羊都可感染且临床表现不同：新生羔羊主要以关节炎、脑炎症状为主；公羊主要以睾丸炎症状为主；母羊主要发生妊娠后期流产、产死胎、弱胎等［6］。母羊在流产后会获得免疫保护，但其仍成为衣原体的携带者，会在发情期将大量的原生小体（EB）排出体外，成为新的传染源［7］。疫苗接种是预防衣原体感染的有效措施，然而由于鸡胚生产疫苗的工艺复杂、耗时费力、成本高等原因，中国市场上还没有商品化的羊衣原体疫苗。临床上一般采用抗生素治疗该病，但容易产生耐药性，引起持续、慢性、亚临床感染［8］。长期使用抗生素对羊地方性流产（Ovine enzootic abor⁃tion，OEA）进行防治并不是一个理想的方法，也不符合当前“减抗限抗”的政策要求。利用现代生物信息学和分子生物学技术寻找羊流产嗜性衣原体新的药物靶标，将为OEA的防控、新型药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 基因组序列与数据库

羊流产嗜性衣原体标准菌株S26/3的全基因组序列来源于NCBI数据库，氨基酸序列通过Artemis导出。直系同源分析时涉及到的数据来源于Database of Interaction Protein（DIP）数据库。

1.2 方法

1.2.1 同源蛋白映射DIP数据库中蛋白与蛋白间的互作关系已经通过酵母双杂交、免疫共沉淀等方法证实。同源蛋白映射（HPM）是通过整合试验中已确定的蛋白-蛋白相互作用信息，来预测未知蛋白间的互作网络［9］。图1展示了同源蛋白映射的原理。例如DIP数据库中C与D能发生互作，而蛋白A与C同源，B与D同源，那么A和B极可能发生相互作用。基于此通过HPM构筑蛋白-蛋白相互作用网络。

图1 同源蛋白映射方法的原理

1.2.2 相互作用网络的构建DIP数据库中的氨基酸序列从DIP网站上下载获得。Blast软件包和羊流产嗜性衣原体的基因组序列从NCBI FTP服务器下载［10］。利用Formatdb将羊流产嗜性衣原体的氨基酸序列建库，DIP数据库中的氨基酸序列与羊流产嗜性衣原体氨基酸序列的同源性通过Blastp确定（E-value 1e-30）。Blastp得到的初步比对结果通过Script程序映射成互作网络，以获得最终的牛支原体蛋白-蛋白相互作用网络。蛋白-蛋白相互作用网络通过可视化软件Cytoscape［11］展示。

表1 本研究中涉及的软件与数据库

2 结果与分析

2.1 羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络

通过同源蛋白映射的方法构建羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络。如图2所示，预测的蛋白互作网络中包含220个蛋白和1 276个相互作用关系，蛋白用圆形的节点表示，相互作用关系用蓝色的直线表示。

图2 羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络

2.2 蛋白相互作用发生频率的分析

在蛋白-蛋白相互作用网络中，互作频率表示某单一蛋白与其他蛋白发生相互作用的数量。互作频率较高的蛋白往往参与细胞的多种生命活动，在细胞的生存中起着十分关键的作用。表2列出了互作频率最高的20个蛋白，大多数蛋白与转录、翻译、分子伴侣等功能相关。CAB_RS01240、CAB_RS03155和CAB_RS01655分别编码伴侣蛋白DnaK、GroEL和DnaJ，这几个蛋白的互作频率较高，且都能与核酸代谢蛋白（如UMP kinase等）、核糖体结构相关蛋白（如CAB_RS00255等）、DNA复制与修复相关蛋白（如CAB_RS00140，CAB_RS02555等）、热休克蛋白（如CAB_RS03085等）发生相互作用。若DnaK、Gro⁃EL和DnaJ的功能受到抑制，将严重影响羊流产衣原体的生存和繁殖，结果提示DnaK、GroEL和DnaJ可以作为新型药物的潜在靶标。

表2 相互作用网络中互作频率较高的20个蛋白

2.3 蛋白相互作用网络中不同功能蛋白的分布

蛋白质直系同源簇（COGs）数据库是对细菌、藻类和真核生物的21个完整基因组的编码蛋白，根据系统进化关系分类构建而成。COGs库常用于未知蛋白的功能预测和蛋白功能的分类研究中。对羊流产嗜性衣原体蛋白相互作用网络中互作频率高于10次的蛋白进行了功能分布分析，首先将互作频率高于10次的蛋白根据蛋白质直系同源簇（COGs）数据库进行功能分类，随后对不同COGs功能类别的蛋白个数进行统计分析，结果如图3所示。互作频率较高的功能蛋白主要与DNA复制、核糖体结构、翻译、分子伴侣和防卫机制等功能相关。DnaK、DnaJ和GroEL均为HSP家族，与ClpB形成多分子伴侣系统。该系统可稳定蛋白质结构，防止蛋白质凝聚、变性，并具有修复变性蛋白的能力，参与多种细胞进程［12］。CAB_RS00140编码DNA拓扑异构酶，拓扑异构酶是生物体内的基础酶类，参与到所有涉及DNA拓扑结构变化的生命活动中，如DNA的复制，转录和重组。核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒，由RNA和蛋白质构成，其惟一功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链，是细胞内蛋白质合成的分子机器。UMP/CMP激酶通过催化UMP、CMP和dCMP转化为二磷酸形式，为核酸合成提供前体方面发挥着至关重要的作用［13］。上述蛋白在维持细胞正常的生命活动中都起着十分关键的作用，若这些蛋白的功能受到抑制将严重影响羊流产嗜性衣原体的生存与繁殖。

图3 羊流产嗜性衣原体蛋白相互作用网络中不同功能蛋白的分布

3 小结与讨论

病原菌互作蛋白组学分析是解析致病相关信号通路和挖掘潜在药物靶标的重要工具［9］。本研究通过HPM的方法构建了羊流产嗜性衣原体的蛋白-蛋白相互作用网络，所构建的互作网络包括220个蛋白和1 276个相互作用关系。HPM方法主要通过同源蛋白映射证实的互作关系，推断功能未知蛋白之间的互作。为了减少假阳性的发生，在构建互作网络时，通过结合序列覆盖率和E-value［14］值综合评价单一蛋白和互作关系的准确性，以确定最终的蛋白互作网络。

在蛋白-蛋白相互作用网络中，蛋白发生互作的频率越高提示该蛋白在病原菌生命活动中越重要。在完成了牛支原体蛋白互作网络的构建后，通过COGs对互作频率最高的20个蛋白进行了功能分类。在这20个蛋白中，大多数蛋白与核糖体、DNA复制与修复、分子伴侣、转录与翻译等功能相关。分子伴侣和核糖体蛋白往往在细胞的生命活动中起着关键的作用，例如伴侣蛋白能帮助蛋白正确折叠和降解，对细胞内病原菌抵抗宿主细胞的环境压力十分重要。在羊流产嗜性衣原体蛋白互作网络中，DnaK、DnaJ和GroEL发生互作的频率较高，能与核糖体蛋白、DNA复制与修复、核酸代谢等多种蛋白发生相互作用。一旦DnaK、DnaJ和GroEL的功能受到抑制，将会对羊流产嗜性衣原体的正常生命活动造成不小的影响。

本研究通过HPM的方法构建了羊流产嗜性衣原体蛋白-蛋白相互作用网络，蛋白互作网络的构建将为新型药物靶标的寻找、新的信号分子的筛选提供依据。