庞亚蓉， 杜 玥， 王志旺， 席建宏， 李济阳， 韦凌霞， 丁茂鹏， 程小丽

(甘肃中医药大学, 兰州 730000)

支气管哮喘(简称哮喘)是以气道慢性炎症为特征的异质性疾病，黏液高分泌是哮喘的基本病理特点[1]，而目前临床上尚未见确切有效的抑制黏液高分泌的药物[2]。《神农本草经》谓当归“主咳逆上气”而临床用于治疗哮喘，丁苯酞是当归苯酞类成分之一。丁苯酞首次发现于芹菜，目前主要用于治疗缺血性脑卒中[3]。前期研究表明，丁苯酞具有抗炎、镇咳和祛痰作用[4]，而进一步研究显示丁苯酞对豚鼠哮喘有明显的治疗作用[5]。本次研究采用卵清白蛋白复制过敏性哮喘小鼠模型，研究丁苯酞对哮喘气道黏液高分泌及IL-13、TNF-α的影响，为其临床治疗哮喘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

上海源叶生物科技有限公司生产的丁苯酞(Butylphthalide, NBP)，批号：20180216，丁苯酞含量98.6%(HPLC法)，使用前以0.5%聚山梨酯-80为乳化剂配置成乳剂；国药集团容生制药有限公司生产的地塞米松磷酸钠注射液(Dexamethasone, DEX)，国药准字：H41020036，批号：18011902；Sigma公司生产的卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)，批号：SLBF0342V(Grade V)。南京建成生物工程研究所生产的IL-13、TNF-α及Muc5ac试剂盒(ELISA)，批号：20180402、20180401、20180305；北京博奥森生物技术有限公司生产的Muc5ac免疫组化试剂盒，批号：180405W。

1.2 仪器

美国CH Technologies公司生产的全身暴露/鼻部暴露吸入染毒系统(GYD-CHT)，德国Sartorius集团生产的电子天平(BS1103)，成都泰盟科技有限公司生产的医学图像分析系统(BI-2000)，日本Olympus生产的光学显微镜(CH-212)，北京普利生仪器有限公司生产的全自动血液流变仪(LBY-N6COMPACT)。

1.3 动物

中国农业科学院兰州兽医研究所提供的SPF级雌性BALB/c小鼠(62000600000082)，体质量16～20 g，饲养于甘肃中医药大学科研实验动物中心(00000115)。

1.4 致敏、激发与给药

取BALB/c小鼠随机分为6组(n=12)，适应性饲养1周。参考文献与预实验[6]，实验第1日开始致敏，模型对照组(Asthma)、阳性对照组(DEX 1.0 mg/kg)以及丁苯酞各干预组(NBP-H 100 mg/kg、NBP-M 50 mg/kg、NBP-L 25 mg/kg)小鼠ip致敏液(为20 μg OVA与2 mg氢氧化铝的生理盐水混悬液)每只200 μl，空白对照组(Control)以生理盐水替代；第8日、15日同法再次致敏。实验第22日开始激发，将小鼠置于染毒系统中，让其吸入超声雾化的1% OVA激发液30 min，3次/周，连续5周，空白对照组以生理盐水替代；各组激发前30 min按上述剂量灌胃给药20 ml/kg，其中空白对照组与模型对照组灌胃等量0.5%聚山梨酯-80，1次/日，连续5周。

1.5 观测哮喘行为学

实验第54日，雾化吸入2% OVA激发液120 s后，观察10 min内小鼠哮喘行为学指标，参考文献[7]方法对小鼠打喷嚏、抓鼻及哮喘发作症状进行半定量分析。

1.6 提取并分析BALF

实验第57日，1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，手术暴露气管，将右支气管结扎，用生理盐水灌洗左支气管及肺泡，将所得支气管肺泡灌洗液(BALF)3 000 r/min离心10 min，取BALF上清液测定其粘度并检测Muc5ac、IL-13及TNF-α的含量。

1.7 分析肺组织杯状细胞增生与黏蛋白表达

于固定位置取右肺组织，通过多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，依次经碘酸、Schiff、苏木素染色(PAS染色)，200倍光镜下观察杯状细胞增生及黏蛋白表达并进行半定量分析。在每只小鼠肺组织中找出5个完整的细支气管(直径150～200 μm)，数出每个细支气管上皮区域内PAS染色阳性细胞数(即杯状细胞数)，测定细支气管的最大直径与最小直径，按椭圆形计算细支气管的周长，用细支气管单位周长杯状细胞数(杯状细胞数/细支气管的周长)来衡量杯状细胞的增生程度[8]。另取肺组织切片，经免疫组化染色，观察Muc5ac的表达特点，采用BI-2000型医学图像分析系统对其进行半定量分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 丁苯酞对小鼠哮喘行为学的影响

造模后期，小鼠激发后出现明显的打喷嚏、抓鼻子，部分动物出现呼吸急促、烦躁不安甚至呼吸困难等哮喘症状。对上述呼吸道症状进行定量分析，结果显示，和空白对照组比较，模型对照组小鼠打喷嚏、抓鼻次数显著增加，哮喘发作的症状显著加重(P<0.01，表1)；采用不同剂量丁苯酞干预后，上述哮喘行为学评分明显下降，和模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。

Tab. 1 Effects of NBP on asthma behaviors in mice n=12)

2.2 丁苯酞对哮喘小鼠气道上皮杯状细胞及其黏液分泌的影响

肺组织经PAS染色后，气道杯状细胞及酸性黏蛋白被染成紫蓝色颗粒状。空白对照组小鼠肺组织镜下染色较浅，气道上皮杯状细胞偶见，黏液不明显(图1A)；模型对照组小鼠肺组织染色明显加深，气道上皮有大量杯状细胞，杯状细胞及气道内充满黏液(图1B)；经丁苯酞干预后，小鼠肺组织染色不同程度变浅，气道上皮杯状细胞减少，气道内黏液量下降(图1D～1F)。对气道上皮中杯状细胞进行定量分析(表2)，表2结果显示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠气道上皮杯状细胞数显著增加；丁苯酞不同剂量组小鼠气道上皮杯状细胞数明显减少，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。

Fig. 1 Effects of NBP on goblet cell and mucus secretion in airway of asthmatic mice (PAS staining ×200)A: Control group; B: Asthma group; C: DEX group; D: NBP-H group; E: NBP-M group; F: NBP-L group

2.3 丁苯酞对哮喘小鼠气道Muc5ac表达的影响

在400倍镜下，气道上皮及气道内壁被染成灰黑色团块状者为黏蛋白5ac(Muc5ac)。空白对照组小鼠气道上皮及气道内Muc5ac不明显(图2A)；模型对照组小鼠肺组织、尤其是气道上皮及气道内Muc5ac明显增加(图2B)，经丁苯酞干预后Muc5ac表达减少(图2D～2F)。对Muc5ac进行半定量分析结果显示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺组织Muc5ac表达的平均光密度值显著增加(P< 0.01，表2)；经丁苯酞干预后，气道Muc5ac表达明显减少，与模型对照组比较有统计学意义(P< 0.01)。

Fig. 2 Effects of NBP on Muc5ac in airway of asthmatic mice (Immunostaining ×400)A: Control group; B: Asthma group; C: DEX group; D: NBP-H group; E: NBP-M group; F: NBP-L group

Tab. 2 Effects of NBP on goblet cell and Muc5ac in asthmatic lung tissues of mice n=12)

2.4 丁苯酞对哮喘小鼠BALF粘度的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)的粘度显著升高(P<0.01, 表3)；与模型对照组比较，经丁苯酞干预后，BALF在低切、中切及高切状态下粘度呈不同程度的降低，差异有统计学意义(P<0.05, 0.01)。

Tab. 3 Effects of NBP on viscosity of BALF in asthmatic mice n=12)

2.5 丁苯酞对哮喘小鼠BALF中Muc5ac、IL-13及TNF-α的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中Muc5ac、IL-13及TNF-α显著升高，差异有统计学意义(P<0.01，表4)；在不同剂量丁苯酞的作用下上述指标明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。

Tab. 4 Effects of NBP on Muc5ac, IL-13 and TNF-α in BALF of asthmatic mice n=12)

3 讨论

1978年杨峻山首次从芹菜籽中分离出左旋丁苯酞，随后发现丁苯酞广泛存在于多种植物中，是当归、川穹、藁本等中药中苯酞类成分之一。目前大量研究显示丁苯酞对脑卒中有明显的保护作用，已成为治疗轻、中度急性缺血性脑卒中的常用药[9]。《神农本草经》记载当归具有“主咳逆上气”之功，临床用于治疗痰、咳、喘等呼吸系统疾病，而作为当归成分之一的丁苯酞对脑卒中后脑组织炎症反应有明显的抑制作用[10]；同时研究发现丁苯酞对哮喘豚鼠模型有治疗作用[5]。本次研究采用卵清白蛋白(OVA)复制哮喘动物模型，随着激发次数的增加，模型对照组小鼠出现打喷嚏、抓鼻及挠痒等行为，部分小鼠表现出哮喘发作的症状。在实验后期对小鼠的上述哮喘行为学进行半定量分析，结果显示丁苯酞可明显降低小鼠上述哮喘行为学评分，缓解哮喘上呼吸道症状。

支气管哮喘(简称哮喘)是呼吸道慢性炎症性疾病，气道黏液高分泌是哮喘的基本特征之一。气道黏液是由多种成分组成的水凝胶，对呼吸道气体进行加湿、加热并吸附气道异物，最后在气道纤毛的推动下以痰的形式吐出[11]。气道黏液高分泌是哮喘的基本病理特征，也是多种呼吸系统疾病发病甚至死亡的原因之一[12]。气道炎症改变了粘膜微环境而引发黏液高分泌，而过度分泌的气道黏液携带大量炎症活性物质并形成凝胶型粘液栓，堵塞细支气管而引起哮喘急性发作甚至致死[13]。气道黏液中黏蛋白的含量不高(约2%)，但是黏液粘弹性的主要来源，目前气道黏液中的黏蛋白已发现20余种，而由气道杯状细胞分泌的黏蛋白5ac(Muc5ac)是哮喘、特别是哮喘持续状态患者痰液中的主要黏性成分[14]。本研究采用OVA复制哮喘动物模型，实验中发现哮喘小鼠气道上皮杯状细胞明显增加，Muc5ac呈高表达态势，BALF中Muc5ac的含量明显增加，导致气道黏液的粘度升高；在丁苯酞的干预下，气道杯状细胞数及Muc5ac的分泌明显下降，气道黏液的粘度下降。

目前研究显示，白介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与哮喘气道杯状细胞增生及黏蛋白高表达有密切的关系。在IL-13缺乏的条件下，其它活性因子都不能诱导气道黏蛋白的分泌，只有完全阻断IL-13才能抑制气道黏蛋白的分泌[15]；TNF-α与TNF受体相关因子2(TRAF2)结合后才能介导Muc5ac基因的表达[16]。本研究中发现，丁苯酞可降低BALF中IL-13、TNF-α的水平，提示丁苯酞抑制杯状细胞化生及Muc5ac高表达可能与抑制IL-13、TNF-α有关。