王春奎， 刘希明， 陶 宏， 段 冶， 刘 伟

(滕州市中心人民医院麻醉科, 山东 滕州 277500)

缺血性心脏病是常见的心血管疾病，严重威胁人类健康。改善心肌供血，恢复缺血部分心肌血液再供是缺血性心脏病的治疗宗旨[1]。但临床显示，缺血心肌再灌注导致心肌细胞代谢障碍及结构功能破坏的程度加重，即产生心肌缺血/再灌注损伤[2]。心肌细胞的缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)是心肌缺血/再灌注损伤的主要病变基础，与心肌细胞氧化应激和凋亡密切相关[3]，降低心肌缺血/再灌注后心肌细胞的氧化应激和凋亡可改善MI/RI。地佐辛(Dezocine)是一种新型的阿片类镇痛药，且对心血管系统和呼吸系统无明显副作用[4]。研究显示，地佐辛预给药可保护肢体缺血再灌注导致的心肌损伤[5]。目前，地佐辛对H/R诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡的影响和作用机制还未知。miR-7a-5p是近年来新发现的一种微小RNA(microRNA，miRNA)。有报道称，短暂局灶性缺血大鼠模型中表达降低，注射miR-7a-5p模拟物可减轻短暂局灶性缺血大鼠氧化应激和脑组织神经元细胞凋亡[6]。生物信息学软件预测显示，泛素E3连接酶10(ubiquitin E3 ligase tripartite motif 10，TRIM10)是miR-7a-5p的靶基因。TRIM10具有E3连接酶功能，参与调节细胞凋亡。研究显示，TRIM10可通过介导p-JNK/p-P38MAPK途径加重MI/RI[7]。但目前，miR-7a-5p能否靶向TRIM10影响H/R的心肌细胞氧化应激和凋亡还未知。本研究以miR-7a-5p/TRIM10轴为切入点，主要探讨了地佐辛对H/R诱导的大鼠心肌细胞H9C2氧化应激和凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂

大鼠心肌细胞株H9C2，上海子实生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、LipofectamineTM2000试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒、DMEM培养基、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)，美国Santa Cruz公司；TRIM10抗体，南京安研生物科技有限公司；miR-7a-5p 模拟物(mimcs)、抑制剂及模拟对照序列，上海吉玛制药技术有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidas，GSH-Px)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞培养

用含10 % FBS的DMEM培养基培养H9C2细胞，培养箱环境为温度37℃、CO2体积分数5 %、O2体积分数95 %。当细胞融合至80 %～90 %时，吸弃培养基，0.25 %胰蛋白酶溶液消化，约1:3比例传代培养。

1.3 H9C2细胞转染

H9C2细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。当细胞融合至60 %时，分别将miR-7a-5p mimics(miR-7a-5p组)及阴性对照(miR-NC组)、miR-7a-5p抑制剂(anti-miR-7a-5p组)及阴性对照(anti-miR-NC组)转染至H9C2细胞，具体操作参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书。转染24 h后，更换培养基。继续培养24 h后，收集细胞备用。

1.4 H9C2细胞分组和处理

未转染的H9C2细胞分为(1)对照组(Con组)：细胞正常培养；(2)H/R组：参照文献方法建立H/R心肌细胞模型[8]，H9C2细胞加入无血清低糖DMEM培养基，置于37℃培养箱中，持续通入含N2体积分数95 % 和CO25 %的混合气体，流速2 L/min，3 h后换用完全培养基，置于37℃、CO2体积分数5 %、O2体积分数95 %的培养箱中培养4 h；(3)低、中、高剂量地佐辛干预组：分别采用10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L[9]的地佐辛预处理H9C2细胞24 h后，再进行H/R处理，分别记为H/R+D-L组、H/R+D-M组和H/R+D-H组。转染后的miR-7a-5p组、miR-NC组H9C2细胞进行H/R处理，分别记为H/R+miR-7a-5p组和H/R+miR-NC组。转染后的anti-miR-7a-5p组、anti-miR-NC组H9C2细胞均用10-5mmol/L的地佐辛预处理24 h后，再进行H/R处理，分别记为H/R+D+anti-miR-7a-5p组、H/R+D+anti-miR-NC。每组细胞设置3个复孔，实验重复3次。

1.5 酶联免疫吸附法检测细胞中MDA、SOD和GSH-Px

各组细胞培养结束后，胰蛋白酶消化，收集细胞。加入细胞裂解液充分裂解，3 500 r/min离心10 min。取上清液，分别参照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒说明书检测上清中各指标水平。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞培养后，胰蛋白酶消化，收集细胞。加入400 μl结合缓冲液，重悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5 μl PI，室温避光孵育5 min。再加入100 μl结合缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测。

1.7 Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax和TRIM10蛋白表达

RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，行10 %十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，湿转至聚偏乙烯二氟膜，并于5 %脱脂奶粉中封闭2 h。分别置于Bcl-2(1∶800)、Bax(1∶800)和TRIM10(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育过夜。加入山羊抗兔二抗(1∶4 000)，37℃孵育1 h。滴加化学发光试剂，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-7a-5p和TRIM10 mRNA表达

Trizol试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度后，逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR反应。反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共45个循环。miR-7a-5p上游5'-GTCCGACGGATGAACGCTCGT-3'，下游5'-TAACCGTCG CTCGTGAAGCGC-3'；TRIM10上5'-CCGTAGTCGTAAGCCACGT-3'，下游5'-GGCGTAAA GCTCGCGTGCG-3'；GAPDH上游5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'，下游5'-TAGCCCAG GATGCCCTTTAGT-3'；U6上游5'-TTGGTATCGTGGAA-GGACTCA-3'，下游5'-TGTCATCA TATTTGGCAGGTT-3'。TRIM10以GAPDH为内参，miR-7a-5p以U6为内参，2-△△Ct法计算miR-7a-5p和TRIM10 mRNA表达水平。

1.9 双荧光素酶报告基因实验

PCR扩增含miR-7a-5p结合位点的TRIM10的3’UTR序列，并采用基因突变技术将结合位点突变，分别构建TRIM10野生型质粒和(TRIM10-WT)和突变型质粒(TRIM10-MUT)。分别将TRIM10-WT或TRIM10-MUT与miR-7a-5p mimic或miR-NC共转染至H9C2细胞。转染24 h后，收集细胞。裂解后，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 地佐辛对H/R诱导的大鼠心肌细胞氧化应激的影响

与Con组比较，H/R组MDA含量升高(P< 0.05)，SOD和GSH-Px活力降低(P<0.05)。与H/R组比较，H/R+D-L组、H/R+D-M组和H/R+D-H组MDA含量均降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力均升高(P<0.05)，且三组间各指标两两比较差异显著(P<0.05，表1)。

Tab. 1 The effects of dizocine on H/R-induced oxidative stress in rat cardiomyocytes n=9)

2.2 地佐辛对H/R诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

与Con组比较，H/R组细胞凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。与H/R组比较，H/R+D-L组、H/R+D-M组和H/R+D-H组细胞凋亡率和Bax蛋白水平均降低(P< 0.05)，Bcl-2蛋白水平均升高(P<0.05)，且三组间各指标两两比较差异显著(P<0.05，图1，表2)。

Fig. 1 The effects of dizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: The effect ofdizocine on the expressions of Bcl-2 and Bax in cardiomyocytes induced by H/R; B: The effect of dizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis

2.3 地佐辛对H/R诱导的大鼠心肌细胞中miR-7a-5p和TRIM10表达的影响

与Con组比较，H/R组miR-7a-5p水平降低(P<0.05)，TRIM10 mRNA和蛋白水平升高(P< 0.05)。与H/R组比较，H/R+D-L组、H/R+D-M组和H/R+D-H组miR-7a-5p水平升高(P<0.05)，TRIM10 的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)，且三组间各指标两两比较差异显著(P<0.05，图2，表3)。

Tab. 2 The effects ofdizocine on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis n=9)

Fig. 2 The effects of dizocine on the protein expression of TRIM10 in H/R-induced cardiomyocyte

Tab. 3 The effects ofdezocine on the expressions of miR-7a-5p and TRIM10 in H/R-induced rat cardiomyocytes n=9)

2.4 miR-7a-5p靶向调控TRIM10的表达

Target Scan在线软件预测显示，TRIM10的3’UTR与miR-7a-5p的核苷酸序列存在连续结合位点(图3A)。miR-7a-5p可降低WT-TRIM10的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而对WT-TRIM10的荧光素酶活性无显著影响(P>0.05，表4)。miR-7a-5p组miR-7a-5p水平高于miR-NC组(3.54±0.135比 1.06±0.07，P<0.05)，TRIM10蛋白水平低于miR-NC组(0.23±0.02比0.49±0.04，P<0.05)；anti-miR-7a-5p组miR-7a-5p水平低于anti-miR-NC组(0.26±0.03比1.05±0.08，P<0.05)，TRIM10蛋白水平高于anti-miR-NC组(0.91±0.08比0.48± 0.05，P<0.05)，进一步说明miR-7a-5p在心肌细胞中靶向负调控TRIM10表达。

Fig. 3 miR-7a-5p targeted regulation of TRIM10 expressionA: The 3'UTR of TRIM10 contains a nucleotide sequence complementary to miR-7a-5p; B: TRIM10 protein expression

Tab. 4 Detection results of luciferase activity n=9)

2.5 miR-7a-5p过表达对H/R诱导的大鼠心肌细胞损伤的影响

H/R+miR-7a-5p组心肌细胞中miR-7a-5p水平高于H/R+miR-NC组(P<0.05)，表明miR-7a-5p mimics转染成功，细胞中miR-7a-5p过表达。与H/R+miR-NC组比较，H/R+miR-7a-5p组MDA含量、细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05，图4，表5)。

Fig. 4 The effects of over-expressing miR-7a-5p on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: The effect of over-expressing miR-7a-5p on the protein expression of TRIM10, Bcl-2 and Bax in H/R-induced cardiomyocyte; B: The effect of over-expressing miR-7a-5p on the apoptosis of cardiomyocyte by H/R induced

Tab. 5 The effects of over-expressing miR-7a-5p on H/R-induced cardiomyocyte injury n=9)

2.6 抑制miR-7a-5p表达逆转了地佐辛对H/R诱导的大鼠心肌细胞损伤的作用

与H/R+D+anti-miR-NC组比较，H/R+D+anti-miR-7a-5p组MDA含量、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05, 图5, 表6)。

3 讨论

心肌缺血/再灌注损伤是一种复杂的多因素病理生理过程，往往伴随着心肌细胞氧化应激和凋亡[10]。MDA作为脂质过氧化的产物，可间接反映细胞氧化应激水平[11]。SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶，两者可协同作用清除自由基，保护氧化应激造成的细胞损伤[12]。本研究显示，H/R处理后，心肌细胞H9C2中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，与相关研究报道结果一致，说明H/R可引起H9C2细胞氧化应激反应。Bcl-2和Bax蛋白是与细胞凋亡密切相关的蛋白，Bcl-2表达升高抑制细胞凋亡，而Bax表达升高则促进蛋白凋miRNA参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为，在心肌疾病的发展中起重要作用[14]。研究显示，miR-7a-5p参与帕金森氏病的发生发展，上调miR-7a-5p表达可降低多巴胺能MN9D细胞凋亡[15]。Zhi等[16]报道称，δ-阿片受体(DOR)激活可防止缺氧/缺血性损伤，而DOR)激活上调了缺氧诱导的大鼠心脏组织中miR-7a-5p表达，提示miR-7a-5p是心脏缺氧诱导损伤的保护因子。本研究显示，H/R处理可降低H9C2细胞中miR-7a-5p表达水平，miR-7a-5p过表达可降低H/R诱导的H9C2细胞MDA含量、细胞凋亡率及Bax蛋白表达，并提高细胞SOD和GSH-Px活力及Bcl-2蛋白表达，说明miR-7a-5p过表达可降低H/R诱导的H9C2细胞氧化应激和凋亡，靶向促进miR-7a-5p表达可能减轻心肌缺血/再灌注损伤。本研究还显示，地佐辛干预后，H/R诱导的H9C2细胞中miR-7a-5p表达升高，而抑制miR-7a-5p表达降低了地佐辛对H/R诱导的H9C2细胞氧化应激和凋亡的抑制作用，提示地佐辛通过上调miR-7a-5p表达抑制H/R诱导的H9C2细胞氧化应激和凋亡。

Fig. 5 Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect of dizoxin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosisA: Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect ofdizocine on the protein expression of TRIM10, Bcl-2 and Bax in H/R-induced cardiomyocyte; B: Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect of dizocine on the apoptosis of cardiomyocyte by H/R induced

亡[13]。本研究显示，H/R处理可提高H9C2细胞凋亡率及细胞中Bax蛋白表达，而降低Bcl-2蛋白表达，说明H/R可诱导H9C2细胞凋亡。而经地佐辛处理后，H/R诱导的H9C2细胞MDA含量降低，SOD和GSH-Px活力升高，表明地佐辛可抑制H/R诱导的H9C2细胞氧化应激。同时，地佐辛还可降低H/R诱导的H9C2细胞凋亡率及Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达，说明地佐辛可抑制H/R诱导的H9C2细胞凋亡，保护细胞损伤。

Tab. 6 Inhibiting miR-7a-5p reversed the effect ofdizocine on H/R-induced myocardial cell injury n=9)

miRNA通常在转录后水平调控靶基因的表达，进而影响细胞的生物学行为。为了进一步探讨地佐辛通过调控miR-7a-5p保护心肌细胞H/R损伤的作用机制，本研究通过生物信息学软件与显示，TRIM10是miR-7a-5p的靶基因，miR-7a-5p可能通过调控TRIM10表达发挥作用。本研究双荧光素酶活性检测结果显示，miR-7a-5p mimics可降低TRIM10野生型的荧光素酶活性，且上调H9C2细胞中miR-7a-5p表达后，TRIM10蛋白表达降低，而下调miR-7a-5p表达后，TRIM10蛋白表达升高，证实了miR-7a-5p在H9C2细胞中靶向负调空TRIM10表达。这也与地佐辛促进H/R诱导的H9C2细胞中miR-7a-5p的表达，而抑制TRIM10的mRNA和蛋白表达的结果一致，提示地佐辛通过上调miR-7a-5p表达进而下调TRIM10表达抑制H/R诱导的H9C2细胞氧化应激和凋亡。

综上所述，地佐辛可降低H/R诱导的H9C2细胞氧化应激和凋亡，其可能通过调控miR-7a-5p/TRIM10轴发挥作用，具有治疗心肌缺血/再灌注损伤的潜在价值。但本研究仅在细胞层面进行了初步探讨，接下来将通过动物模型实验进一步验证地佐辛保护心肌缺血/再灌注损伤的作用并探讨其可能的其他作用机制。