欧阳昕， 李 清， 肖爱娇△， 陈明人

(1. 江西中医药大学岐黄国医书院， 南昌 330004； 2. 江西中医药大学中医学院， 南昌 330004； 3. 江西中医药大学针灸推拿学院，南昌 330004 )

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemia encephalopathy,HIE)是指围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤[1]。从发病机制上来说，该病涉及的病理生理过程十分复杂，有许多相互关联的机制在起作用，其中氧化应激为其重要的发病机制之一[2，3]。它会使活性氧产生，且迅速增加并抵抗抗氧化剂的防御[4]，造成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性降低，丙二醛(malondialdehyd,MDA)含量增加[5，6]，从而引起脑组织损伤。从治疗上而言，目前对于该病尚未形成统一的治疗方案，最新的动物实验研究表明艾灸能够减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤[7]。然而，艾灸能否通过提高抗氧化应激能力，达到减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤、改善行为学表现的作用机制还不十分清楚。为此，本研究在前述研究[7-9]的基础上，探讨艾灸对脑组织中SOD蛋白表达和MDA含量的影响，测试小鼠的行为学表现和脑组织形态结构变化，阐明艾灸治疗新生小鼠HIE的作用机制，提供临床应用艾灸防治新生儿HIE实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康ICR小鼠16只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号为SCXK(湘)2013-0004。孕21 d，待其自然分娩，使用新生小鼠106只，雌雄不限。实验过程中，所有鼠均在室温(24±2)℃、相对湿度(50±5) %、光照周期(11±1) h 的动物房中饲养。

1.2 主要试剂和仪器

1.3 动物分组及HIE新生小鼠模型制备

将所有新生小鼠随机分为假手术组、模型组和艾灸组。假手术组(23只)只做颈部切口，不做缺血、缺氧处理；模型组(46只)在颈部切开后分离、闭合左侧颈总动脉，并做缺氧处理；艾灸组(37只)同模型组，并施予艾灸治疗。关于制备HIE新生小鼠模型的具体方法，详见参考文献[7-9]。

1.4 艾灸治疗

造模后2 h艾灸组开始艾灸治疗：用直径4 mm×长100 mm的艾条，在“大椎”穴施行温和灸(距穴位2 cm左右)，每天1次，每次35 min，连续4 d (即造模后2 h, 24 h, 48 h 和72 h)。该穴定位参考文献[10]中小鼠的腧穴定位：第7颈椎与第1胸椎棘突间，背部正中。假手术组和模型组新生鼠均不予艾灸治疗。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 行为学测试 于造模后1 d和3 d，参考文献[6]对各组小鼠进行测试。

1.5.2 脑组织病理检查 于造模后3 d，各组分别取5只鼠，观察脑组织形态。小鼠麻醉后迅速取脑，数码相机拍照，随后切片、HE染色、封片，最后在镜下(×200)观察患侧脑大脑皮质形态结构。HE染色具体操作方法参见文献[7]。

1.5.3 脑组织SOD2蛋白检测 于造模后3 d，各组分别取4只鼠左侧大脑皮质采用Western blot技术进行检测。给予小鼠异氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取脑，参见文献[11]检测SOD2蛋白表达水平。

1.5.4 脑组织MDA含量测定 于造模后3 d，各组分别取6只鼠左侧大脑皮质采用分光光度法进行测定。给予小鼠异氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取脑，参见文献[11]测定MDA水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 艾灸对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠行为学测试结果的影响

翻正反射：造模后1 d，模型组和艾灸组小鼠均出现神经功能障碍，表现为翻正反射时间较假手术组延长；造模后3 d，假手术组、模型组和艾灸组小鼠翻正反射时间均缩短，但模型组比假手术组长(P<0.05)，艾灸组比模型组短(P<0.05，表1)。

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Tab. 1 Comparison of righting reflex of mice among three groups (s，

趋地反射：造模后1 d，模型组和艾灸组小鼠趋地反射时间较假手术组延长；造模后3 d，假手术组、模型组和艾灸组小鼠趋地反射时间均缩短，但模型组比假手术组长(P<0.05)，艾灸组比模型组短(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of geotaxis reflex of mice among three groups (s，

悬崖躲避试验：造模后1 d，模型组和艾灸组小鼠悬崖躲避试验时间较假手术组延长；造模后3 d，假手术组、模型组和艾灸组小鼠悬崖躲避试验时间均缩短，但模型组比假手术组长(P<0.05)，艾灸组比模型组短(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of cliff avoidance reaction of mice among three groups (s，

抓力试验：造模后1 d，模型组和艾灸组小鼠抓力试验时间较假手术组缩短；造模后3 d，假手术组、模型组和艾灸组小鼠抓力试验时间均延长，但模型组比假手术组短(P<0.05)，艾灸组比模型组长(P<0.05，表4)。

Tab. 4 Comparison of grip ability of mice among three groups (s，

2.2 艾灸对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠脑组织形态结构的影响

2.2.1 肉眼观察 假手术组：脑组织红润，脑沟及脑回清晰；模型组：左侧脑组织苍白、出现液化，脑沟变浅、脑回增宽；艾灸组：左侧脑组织出现小面积梗死灶，脑组织较红润，脑沟及脑回较清晰(图1)。

Fig. 1 Gross observation of brain morphological structure among three groups of mice Dotted frame indicated injury sites

2.2.2 镜下观察 假手术组：脑组织细胞排列致密整齐；模型组：梗死侧脑组织细胞大量变性坏死、脱落，周围间隙扩大；艾灸组：梗死侧脑组织细胞排列较致密整齐(图2)。

Fig. 2 HE staining results of brain morphological structure among three groups of mice(Scale bar=50 μm) Arrows indicated injury sites

2.2.3 艾灸对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠脑组织SOD2蛋白表达和MDA含量的影响 从图中可以看出，GAPDH和SOD2蛋白分别于分子量标准的37 kDa、25 kDa处出现清晰的条带。经统计分析，模型组小鼠脑组织SOD2蛋白的相对表达量明显少于假手术组(P<0.05)，而艾灸组小鼠脑组织SOD2蛋白的相对表达量显著多于模型组(P<0.05，图3，表5)。

从表5可以看出，模型组小鼠脑组织MDA的含量高于假手术组，而艾灸组小鼠脑组织MDA的含量显著低于模型组(P<0.05，表5)。

Fig. 3 The expressions of SOD2 protein in brain tissues of mice detected by Western blot among three groups1: Sham group; 2: Model group; 3: Moxibustion group

Tab. 5 Comparison of the expressions of SOD2 protein and the content of MDA in brain tissues of mice among three groups

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病属于难治的脑损伤疾病，涉及群体很大，据最新的资料统计，在发达国家，该病的发病率约为1.5‰[12]，而在发展中国家，该病的发病率还要高很多，约为10‰～20‰[12]。此外，该病还具有较高的致死率和致残率[13，14]，这不仅严重影响了患儿的康复成长，而且会造成家庭和国家繁重的经济负担和社会压力。因此，加强研究治疗新生儿HIE具有重要的意义。

对于该病的治疗，西医多采用低温疗法和高压氧疗法等[15-18]，但是这些治疗方法都具有一定的副作用，如许多患者(足月产低体重儿以及早产儿)并不适合用低温疗法[15，16]，且接受低温治疗的患儿中仍有40%～50%死亡或伴有严重的神经系统发育异常[17]；高压氧疗法有可能出现晶体后纤维增生症[18]等副作用。此外，潘友灿等[19]也指出，西医对缺氧缺血性脑病的有效治疗方案有限，因此替代疗法受到越来越多的关注。

中医作为西方医学重要的替代疗法，其中的艾灸疗法因具有简、便、廉、效、不良反应少等特点，而被人们广泛接受使用。它是以艾热刺激体表穴位或特定部位，发挥着温通经脉、行气活血等作用，在防治心脑血管疾病中发挥着重要作用[20]。在脑病的治疗中，“历代医家素有病变在脑首取督脉之说”[21]。而大椎穴为督脉上的要穴，具有调节手足阳经气血和补益脑髓等作用，因此本课题组选取位于督脉上的大椎穴对HIE新生小鼠进行艾灸治疗。值得注意的是，虽然临床上未见有关艾灸治疗新生儿HIE的公开报道，但本课题组前期实验研究发现艾灸能够减轻HIE新生小鼠脑损伤[7]。本次实验研究观察到模型组小鼠翻正反射、趋地反射、悬崖躲避试验时间延长，抓力试验时间减短，脑组织细胞大量脱落，表明模型组小鼠存在感觉、运动功能异常，脑组织损伤程度较重,与文献[22]报道相似；经艾灸治疗后，该组小鼠翻正反射、趋地反射、悬崖躲避试验时间缩短，抓力试验时间增长，脑组织细胞排列较整齐，表明艾灸组小鼠感觉、运动功能得到改善，脑组织损伤程度较轻。这就说明艾灸可能对新生儿HIE能起到一定的治疗作用，因而深入探讨艾灸治疗新生儿HIE的作用机制具有重要的意义。

新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制很复杂，涉及细胞凋亡、氧化应激等[12]，其中氧化应激为重要的发病机制之一[2，3]。当发生氧化应激时，机体产生大量氧自由基，这些物质会使细胞膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生过多的脂质过氧化物，从而破坏细胞膜，导致脑损伤。SOD是人体内十分重要的抗氧化酶，分布于全身各组织中，主要有3种类型：SOD1分布在胞浆和血浆，SOD2分布于线粒体，胞外SOD分布在细胞间隙。SOD具有清除自由基的作用，其活性的高低反映了机体抗氧化能力的强弱。一般来说，SOD与超氧阴离子反应形成过氧化氢，再经过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶转变成水，从而使自由基清除，保护细胞免受损伤。因此，SOD也被看作为活性氧防御的第一线。MDA是氧化反应的最终产物，可以作为过氧化产物的标志物。有研究报道，新生鼠缺氧缺血性脑损伤发生后脑组织中MDA含量增加，而SOD活性下降[5，6]。林才等[23]研究发现，HIE患儿体内自由基含量增多、SOD蛋白水平降低。由此推测，HIE新生小鼠体内SOD蛋白水平降低、MDA含量增高。

根据以上的研究成果，本课题组提出如下假设：艾灸减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤、改善行为学表现，可能与增加脑组织中的SOD2蛋白的表达、降低脑组织中的MDA的含量有关。为验证这一假说，我们进行了大量的动物实验研究。在实验研究中，将小鼠随机分为三组。一是假手术组，该组小鼠脑组织中的SOD2蛋白表达量和MDA的含量均正常；二是模型组，相比于假手术组，该组小鼠脑组织中的SOD2蛋白表达量减少，而MDA的含量增高；三是艾灸组，相比于模型组，该组小鼠脑组织中的SOD2蛋白表达量增多，而MDA的含量显著降低。这一实验结果表明经艾灸治疗后，机体抗氧化酶SOD2表达增多，MDA的含量减少，抗氧化能力增强，从而缓解了氧化应激，达到了治疗效果。

综上，本研究表明，艾灸能减轻HIE新生小鼠脑损伤、改善行为学表现，其作用可能与其增加脑组织SOD2蛋白的表达、降低MDA含量，提高抗氧化应激能力有关。这一研究结果为艾灸在新生儿HIE临床应用提供了科学线索，有助于促进艾灸在新生儿HIE临床中的应用。