廖益民，沈国正，骆慧枫，黄康康，裴嘉博，郗笃隽，张琛，阮若昕，刘辉*

(1.建德市农业技术推广中心，浙江 建德 311600；2.杭州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 杭州 310024)

甜樱桃(PrunusaviumL.)是落叶果树中继中国樱桃之后成熟最早的水果，其颜色艳丽、风味浓郁、绿色健康，深受我国消费者青睐[1]。果实品质、产量、植株抗性与砧木密切相关，甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)由德国育成，为酸樱桃(Prununcerasus)和灰毛叶樱桃(Prununcanescens)杂交培育而成。其中吉塞拉6号具有较好的矮化性、丰产性和抗逆性，与大多数甜樱桃品种具有较强的亲和性[2]。与吉塞拉5号相比，吉塞拉6号长势更强，“小脚病”较弱；与吉塞拉12号相比，吉塞拉6号矮化性更好，适宜于南方暖湿地区栽培。

吉塞拉6号为3倍体，主要采用扦插繁殖，生根率为80%[3]。组织培养技术可以优质高效地实现种苗的快速繁殖，为了加快砧木的繁殖速率，打破季节限制，提高苗木整齐性，本研究以吉塞拉6号为实验材料，采用组织培养的繁殖方式，分析影响组培苗生根的关键因子，得出吉塞拉6号适宜的培养体系，为实现工厂化、稳定化育苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

吉塞拉6号外植体材料来自杭州市农业科学研究院种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 无菌系建立

在晴朗天气，选择长势良好、无病虫害的半木质化枝条，除去叶片，剪成1 cm左右的带芽茎段，将茎段用肥皂水振荡冲洗10 min，用流动自来水冲洗60 min，放置超净台，用灭菌的滤纸吸干水分，转移到灭菌的空瓶中，加入75%乙醇浸泡45 s后，加入0.1%的HgCl2溶液分别振荡灭菌8 min和10 min，用无菌水冲洗4遍，切下芽尖，接种在初代培养基上：MS(MS+6 g·L-1琼脂)+30 g·L-1蔗糖+0.2 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-16-BA，pH 5.8，置于培养室培养(图1中A～D)。培养条件为光照周期10 h/14 h，光照强度2 000 lx，温度24 ℃。每个处理10瓶，重复3遍，接种10 d后统计污染率。

1.2.2 增殖培养

出芽后将长势健壮的嫩芽切成1 cm左右小段，转移至增殖培养基中(图1中E～F)。选取文献中最适宜的2种培养基类型，分别为(A1)MS+0.1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(A2)MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8[4-5]。每个处理10瓶，重复3次，培养20 d后统计成活情况和增殖情况，培养条件同上。

1.2.3 生根培养

将增殖后的丛生芽切成单芽，将1.5 cm以上的单芽接种至生根培养基中。培养基为1/2 MS(1/2 MS+6 g·L-1琼脂)+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8。分别遮光培养7、11、15 d后光照培养(B1-B3)，每个处理20瓶，重复3次，培养30 d后统计生根情况。

将增殖后的丛生芽切成单芽，将1.5 cm以上的单芽接种至生根培养基中。培养基分别为(C1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8；(C2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8。遮光培养15 d后光照培养，每个处理20瓶，重复3次，培养45 d后统计生根情况。

将增殖后的丛生芽切成单芽，将1.5 cm以上的单芽接种至生根培养基中。培养基分别为(D1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.1% Ac，pH 5.8；(D2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.05% Ac，pH 5.8；(D3)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。遮光培养15 d后光照培养，每个处理20瓶，重复3次，培养30 d后统计生根情况。

将增殖后的丛生芽切成单芽，将1.5 cm以上的单芽接种至生根培养基中。培养基分别为(E1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(E2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(E3)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；遮光培养15 d后光照培养，每个处理20瓶，重复3次，培养30 d后统计生根情况。

将增殖后的丛生芽切成单芽，将1.5 cm以上的单芽插至不同的湿润的培养介质中，处理如下：(F1)椰糠；(F2)草炭；(F3)珍珠岩；(F4)河沙。遮光培养15 d后光照培养，每个处理5瓶，重复3次，培养30 d后统计生根情况。

1.2.4 组培苗驯化移栽

将组培苗移至温室中，自然光下驯化10 d，取出幼苗，洗净根上的培养基，800倍多菌灵溶液速蘸后，种植到穴盘中，透明育苗盖覆盖7 d后揭开。组培苗长出7片成熟新叶片后移栽至育苗床中(图1中K～L)。

A～D—芽尖培养；E～F—增殖培养；G～J—生根培养;K～L组培苗移栽至育苗床中。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对外植体成活率的影响

采用HgCl2灭菌外植体成活率较高，污染率较低，主要为真菌性污染。不同灭菌时间对吉塞拉6号外植体成活率有一定的影响，灭菌时间为8 min时，出芽率较高，达93.9%，污染率也较高，为18.2%。灭菌时间为10 min时，出芽率为89.4%，轻微褐化，污染率为9.1%(表1)。说明灭菌时间越长，污染率越低，出芽率也降低，出现褐化现象。

表1 不同灭菌时间对外植体成活率的影响

2.2 不同培养基对增殖的影响

选取2种最适宜的增殖培养基进行试验。结果表明，不同激素诱导和增殖效果不同。增殖培养20 d后，处理1增殖倍数为3.8，芽平均高度为2.2 cm；处理2增殖倍数为4.7，芽平均高度为2.5 cm(表2)。说明处理2培养效果优于处理1，更适宜作为增殖培养基。

表2 不同培养基对增殖的影响

2.3 不同遮光时间对生根的影响

由表3可见，吉塞拉6号组培苗生根率较低，同时，遮光时间不同对生根率和组培苗有一定影响。随着遮光时间增加，生根率增加，遮光时间为15 d时，生根率为36.7%，根数较少，细短且弯曲(图2中A)。

表3 不同遮光时时间对生根的影响

2.4 不同碳源种类对生根的影响

组织培养中碳源的种类通常为蔗糖和葡萄糖，试验表明，不同碳源类型对吉塞拉6号的生根作用影响显著(表4)，其中以蔗糖为碳源的培养基生根率为47.5%，平均根长为3.2 cm，生根效果优于葡萄糖。但是茎叶仍然短小，生根效率不高。

表4 不同碳源种类对生根的影响

2.5 不同活性炭含量对生根的影响

有研究表明活性炭具有吸附有害代谢物质，提供黑暗环境的作用，能够抑制褐化现象，促进成苗率。试验结果表明，活性炭含量为0.1%时，生根率为29.1%(表5)。随着活性炭含量减少，生根率增加，活性炭含量为0时，生根率显著提高，高达76.7%，平均根数增加，根粗长，茎叶健壮。

表5 不同活性炭含量对生根的影响

2.6 不同激素浓度对生根的影响

由表6可知，激素浓度对组培苗生长具有较大的影响，其中NAA浓度为0.1 mg·L-1时，生根率为88.24%，丛枝数较多(图2中D)。当NAA浓度为0.3 mg·L-1时，第5 d开始生根(图1中G)，第12 d后生根率达到100%(图1中H)，28 d后根系白色、粗壮(图1中K～L)；平均根数为7.3 cm，平均根长为6.3 cm；茎段长5.9 cm，茎叶健壮，丛枝率减少。

表6 不同激素浓度对生根的影响

2.7 不同培养介质对扦插生根的影响

为提高组培苗韧性，采用不同介质进行扦插生根。试验结果表明，以椰糠和草炭为培养介质的生根率最高，为75%(表7)。其中以椰糠为介质的组培苗根系多，平均根数为7.5条，平均根长为5.34 cm，茎叶健壮。以珍珠岩为介质的组培苗根粗短，以河沙为介质的组培苗根系分叉较多，长度均匀，但是叶片存在斑状焦枯(图2中E～H)。

表7 不同培养介质对扦插生根的影响

A—遮光时间15 d；B—碳源 蔗糖；C—活性炭0.00%；D—激素浓度0.3 mg·L-1；E～H—不同基质。

3 小结与讨论

试验表明，吉塞拉6号组培快繁最佳灭菌方法为75%乙醇灭菌灭菌30 s、0.1% HgCl2灭菌10 min，初代培养基为MS+0.2 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8，最佳增殖培养基为MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8，最佳生根培养基为1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。

培养基类型、植物生长调节剂含量、培养环境等对组织培养都有重要的影响[6]。在南方地区，吉塞拉6号组培苗生根困难[7]。部分研究表明培养基中加入活性炭能够创造黑暗的环境，促使根系分泌生长素，有利于根系生长[5,8]。在本研究中，活性炭是制约吉塞拉6号生根的关键因素。活性炭具有非选择性吸附作用，它在吸附有害物质的同时，还会吸收培养基中的生长调节剂和营养物质，影响了组培苗的生长。在樱花组培中，IBA和NAA的配合使用优于单独使用，生根率可达100%[9]。本研究结果证明，在吉塞拉6号组培中，IBA和NAA配合使用能够提高生根率，效果显著。组培苗在培养基中生根率高，根系发达，但存在株与株间根系缠绕，根系较脆，缺乏韧性，移栽时不易分离，损伤较大，易长霉菌。直接采用栽培基质生根可以减少损失，提高移栽成活率。以椰糠和草炭为介质，能增强根系韧性，提高移栽成活率，生根率有待于进一步提高。