郭 涛， 张永杰， 赵晓明， 董玲玲， 何红云， 邓仪昊

（昆明理工大学医学院解剖学教研室，脑卒中病理机制研究实验室，云南昆明650500）

脑卒中是最常见的神经疾病，是世界范围内死亡的第二大原因和长期致残的主要原因［1］，其中大约87%的卒中病例为缺血性脑损伤［2］。脑缺血后的神经元损伤是由复杂的病理因素引起的［3］，包括炎症［4］、氧化应激［5］、酸中毒［6］和兴奋性毒性［7］，导致细胞死亡［8］。而脑缺血引起3 种形态的细胞死亡：自噬、凋亡和坏死［9］，目前对于它们之间相互的转换和调控关系却知之甚少。自噬是一个细胞过程，通过溶酶体降解回收聚集的蛋白质、受损的细胞器和某些病原体，并通过向缺血细胞提供额外的能量供应和营养来提高细胞存活［10］。然而，自噬为一把双刃剑，适当激活的自噬有益于大脑局部缺血后的神经元存活［11］，而过度活化的自噬最终导致细胞死亡［12］。凋亡是另一种类型的细胞死亡，经历凋亡的细胞以有组织的方式主动进行拆除，使邻近神经细胞的损伤和破坏达到最小，在疾病中对组织内环境的稳态和发育起着重要作用［13］。

基于本实验室先前的研究和众多研究者观察，脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）发生后，自噬和凋亡被显著激活，并且针对自噬和凋亡信号通路的干预治疗在脑卒中疾病中发挥重要作用。但目前对于脑I/R 大鼠常用模型中自噬和凋亡不同时点表达水平的动态变化缺少统一的整理，研究者确定模型的时点和不同时期又各有不同，本文作为基础研究在时间选择上可以作为参考依据。事实上，缺血后病理过程中的细胞自噬和凋亡之间存在密切联系。在缺血性脑卒中后的梗死核心区主要发生坏死，而周围半暗区的细胞遭受自噬和凋亡，但不恰当的自噬或过度凋亡可能导致细胞死亡［14］。

另外，研究表明通过调节自噬和凋亡活性可以获得针对脑I/R 损伤的神经保护作用［15］。自噬和凋亡二者在脑卒中是否存在相互转换，如何在不同时期使自噬和凋亡表达水平达到一个动态平衡及适度的活化状态从而发挥神经保护功能，将是本文的研究重点。总之，研究大鼠脑I/R 后细胞自噬和凋亡不同时点的动态变化，并讨论它们之间的相关变化和对神经行为学、病理学发展的影响，可以找到新的线索来改善缺血性脑卒中的治疗。

材料和方法

1 实验动物

选用SPF 级体质量为250～280 g（8 周龄）的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004。本研究共使用了255 只大鼠：45 只大鼠术后死亡（死亡率为17.65%），纳入210 只大鼠，138只大鼠分别用于评估神经功能缺损和Western blot实验，36 只大鼠用于脑梗死体积测量，其余36 只大鼠进行免疫荧光实验。假手术（sham）组作为对照，每个时点为6 只大鼠（n=6）。每只大鼠在黑暗环境各12 h 和（22±1）℃下用福利动物程序饲养，随意饮用水和食物。所有大鼠实验均经昆明理工大学动物委员会批准。

2 试剂和仪器

BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液和 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）试剂（碧云天生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔Ⅱ抗、微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated proteins 1 light chain 3，LC3）抗体、cleaved caspase-3（C-caspase-3）抗体、β-actin抗体、TUNEL 和DAPI 购自 Cell Signaling Technology；水合氯醛、电泳液、转膜液和0.2%Triton X-100 购自北京Solarbio 科技有限公司。脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；冰冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；电泳仪及转膜仪（上海天能科技有限公司）。

3 实验方法

3.1 动物模型制备 参照改良Zea Longa 法［16］制备左侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛（360 mg/kg）麻醉大鼠，置于加热垫上保持体温为（37.0±0.5）℃，左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）分别与邻近肌肉和神经分开，并完全暴露。从ECA 的小切口插入涂有多聚赖氨酸圆形末端的栓线（直径0.36 mm；北京西浓生物技术有限公司），并回到CCA，然后从ICA 进入大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA），90 min 后拔出栓线，恢复血流。Sham 组的大鼠接受相同的手术，除了不插入拴线。

3.2 评估神经缺陷 分别在 I/R 后的 1～12 h、1～7 d、14 d、21 d 和28 d，采用改良神经损伤严重程度评分（modified neurological severity scores，mNSS）评估大鼠神经功能损伤情况（18 分制）［17］：分别从运动测试（正常0 分，最大6 分）、感觉实验（正常0 分，最大2分）、平衡木实验（正常0分，最大6分）和反射缺失或异常运动（正常0分，最大4分）4个方面进行评分。

3.3 蛋白质提取和Western blot 技术 神经功能缺损评分后，在每个时点处死大鼠，冰上分离大脑皮层半暗区组织。通过自动研磨器将组织匀浆，用RIPA缓冲液裂解1 h，之后在冰冻离心机于4 ℃、12 800×g离心15 min 获得上清蛋白。通过SDS-PAGE 分离上清液中的蛋白质并将其转移到PVDF膜中，在室温下用10%脱脂牛奶封闭2 h。TPBS 洗涤PVDF 膜后，孵育 C-caspase-3、LC3 和 β-actin（1∶1 000）Ⅰ抗 4 ℃过夜。再次将膜与HRP 偶联的Ⅱ抗在室温下孵育1 h。用化学发光液通过BIO-RAD 系统曝光拍照，ImageJ软件分析条带灰度。

3.4 脑梗死体积的测量 在sham 组和特征时点（6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d）用10%水合氯醛（400 mg/kg）注射深度麻醉，取脑并在-20 ℃下冷冻20 min，然后用脑槽切片分成2 mm 厚的脑片。在TTC 溶液中染色30 min，并用4%多聚甲醛固定12 h。TTC 染色显示梗死区组织呈苍白色，正常脑组织为暗红色。通过成像软件（Adobe Photoshop 7.0）计算梗死体积，并通过梗死率（%）=A°/A′×100%来确定，A°代表梗死体积，A′代表同侧半球的体积。

3.5 免疫荧光染色 同样，在6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 将大鼠麻醉并用生理盐水经心脏灌注，然后用4%多聚甲醛固定，取出完整大脑再用20%蔗糖溶液脱水，之后使用冷冻切片机冠状位切成20 μm 厚的脑片，原位杂交保护液保存待用。用PBS 洗涤脑片，再用0.2% Triton X-100 透化15 min，10%正常牛血清封闭45 min，然后将脑片在4 ℃分别与LC3抗体和TUNEL 染液孵育过夜，37 ℃避光孵育荧光Ⅱ抗（1∶800）1 h，之后于DAPI溶液复染细胞核5 min，贴于载玻片并以抗荧光淬灭剂封片。通过荧光显微镜检测反应信号，评估阳性细胞的百分比。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析。所有数据都以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 I/R后神经功能缺损情况的变化

相对于sham 组，脑I/R 大鼠模型在1 h 神经功能显著缺损（P＜0.05），随后1～6 h神经功能缺损评分逐渐增加，6～12 h 继续增加，在 I/R 后 4 d 达到最高水平，这几个阶段之间的差异均有统计学意义（P＜0.05），然后维持此水平直到I/R 后28 d；假手术组中的所有大鼠都没有表现出神经缺陷，见图1。

2 I/R后自噬相关蛋白LC3的表达时间谱

与sham 组相比，大鼠脑I/R 后1 h 半暗区的自噬显著激活（P＜0.05），LC3-II/LC3-I 比值从1～6 h 的脑缺血急性期逐渐增加，并且在12 h达到最高水平（P＜0.05），在12 h～2 d 持续降低（P＜0.05），在3～6 d 又开始增加（P＜0.05），之后（7～28 d）维持在较高水平（没有显著波动），见图2。

3 I/R后凋亡相关蛋白C-caspase-3的表达时间谱

脑I/R 后半暗区C-caspase-3的表达在1 h明显激活（P＜0.05），并在1～6 h 逐渐增大，直至12 h 后达到最大值（P＜0.05）；之后1～7 d，C-caspase-3 的表达持续下降（P＜0.05），在7～28 d 时段里下降更明显（P＜0.05），且降至与sham组相近的表达水平，见图3。

4 I/R后半暗区自噬与凋亡转换的动态变化

为了观察脑I/R 大鼠模型半暗区中细胞自噬与凋亡之间的相关变化，我们评估了LC3/C-caspase-3比值的差异。结果显示，自噬和凋亡在I/R 后12 h内保持稳定，处于一种平衡状态，无显著差异；但在12 h～2 d，LC3/C-caspase-3 比值显著降低（P＜0.05），自噬和凋亡水平在此阶段均出现相对于12 h 的降低；不同的是，LC3/C-caspase-3 比值在3 d 时突然逆转，稳定增加至 7 d，并在 7～28 d 持续快速增加（P＜0.05），显示出在大鼠I/R 后的亚急性期自噬水平升高而凋亡水平降低的现象，见图4。

Figure 1. Dynamic changes of neurological deficit scores at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h.图1 脑缺血再灌注后不同时点神经功能缺损评分的动态变化

Figure 2. Dynamic changes of LC3 expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h；☆P＜0.05 vs 2 d.图2 脑缺血再灌注后不同时点半暗区LC3表达水平的动态变化

Figure 3. Dynamic changes of cleaved caspase-3（C-caspase-3）expression level in the penumbra at different time points after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 1 h；△P＜0.05 vs 6 h；▲P＜0.05 vs 12 h；☆P＜0.05 vs 7 d.图3 脑缺血再灌注后不同时点半暗区C-caspase-3表达水平的动态变化

5 I/R后脑梗死体积的变化

通过自噬与凋亡的表达在脑I/R 大鼠模型中动态变化的比较分析，选择出特征时点6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 进行脑梗死体积检测。结果显示，与sham组相比，I/R后的急性期（6 h），脑梗死体积快速扩大，6～12 h 脑梗死体积持续急速增大（P＜0.01）；随后在亚急性期（12 h～2 d、2～7 d 和7～28 d），脑梗死体积依旧持续增加（P＜0.05），但相比急性期增速放缓，并在28 d 观察到脑梗死核心区组织发生液化坏死现象，见图5。

6 免疫荧光法检测I/R后自噬和凋亡的转换

为了进一步验证脑I/R 后特征时点6 h、12 h、2 d、7 d 和28 d 半影区组织中自噬和凋亡的水平，我们通过免疫荧光评估LC3表达和TUNEL染色情况。正如 Western bolt 结果一样，LC3 和 TUNEL 阳性细胞百分比在缺血后6 h内逐渐增加，并且在12 h达到最大值（P＜0.05）；此后LC3阳性细胞的百分比在2 d显著下降（P＜0.05），之后几周再次增长并维持在较高水平；但TUNEL 阳性细胞的比例从12 h至2 d相比LC3降低较少，与自噬水平趋势相反的是，凋亡水平在2～28 d持续降低（P＜0.05），见图6。

讨 论

Figure 4. Differential variations of autophagy and apoptosis in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 12 h；#P＜0.05 vs 2 d；△P＜0.05 vs 7 d.图4 脑缺血再灌注后半暗区自噬和凋亡的差异性变化

Figure 5. The change of cerebral infarct volume after cerebral ischemia-reperfusion（TTC staining）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h；▲P＜0.05 vs 2 d；☆P＜0.05 vs 7 d.图5 脑缺血再灌注后脑梗死体积的变化

脑缺血一旦发生，半暗区的自噬机制和凋亡信号都显著激活［18］，提示针对神经细胞的拯救在脑I/R的病理生理过程中极为重要。自噬和凋亡分子机制存在共同通路，但它们在脑缺血中显示的特异性效果却不明确。过去的认识认为坏死是一种无法控制和不受管制的过程，而最近的研究表明坏死受调节的方式而改变，并且与细胞自噬和凋亡都具有共同的特征［19］。因此坏死、自噬和凋亡密切相关，参与了包括缺血性脑卒中在内的各种疾病的发病机制［20］。洞察他们的相互作用和机制对找到更有效的脑缺血治疗方法很重要。

缺血核心区由于MCA 血流完全堵塞致使脑细胞死亡。而外围的缺血半暗区被定义为具有形态完整性和保持能量代谢而氧、葡萄糖缺失的脑组织，是介于梗死灶和正常组织之间的移行区域，由于侧支循环存在，仍可获得部分血液能量供给，因而具有恢复能力［21］。研究观察，脑I/R 后缺血半暗区可持续超过12 h，这为抢救提供了潜在机会［22］。与本文的研究结果类似，从脑缺血发生至4 d脑梗死体积持续扩大，表明在此期间的细胞调控都具有一定意义，并且提示早期12 h前及时治疗对减少梗死体积的效果更佳。而自噬是一种可逆的细胞死亡形式，可以使细胞重生，其与坏死和凋亡使细胞最终走向死亡的命运不同，所以缺血半暗区的自噬是脑卒中具有吸引力的治疗靶点。在Western blot技术中膜型LC3-II与胞浆型LC3-I 比值的大小可评估自噬水平的高低，LC3被作为自噬体形成的标志［23］，C-caspase-3是凋亡启动的必要条件［24］，因此，本研究中 LC3 和 C-caspase-3分别作为检测自噬和凋亡水平的金指标。

Figure 6. Expression level of LC3 detected by immunofluorescence（A）and TUNEL staining（B）in the penumbra after cerebral ischemia-reperfusion. Autophagic cells were stained with LC3 antibody（red），apoptotic cells were TUNEL staining positive（green），and cell nuclei were visualized by DAPI（blue）. The scale bar=10 μm. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h；▲P＜0.05 vs 2 d；☆P＜0.05 vs 7 d.图6 脑缺血再灌注半暗区LC3表达水平和TUNEL染色

我们的结果显示，脑梗死体积在大鼠脑I/R 后12 h 内快速扩大，同时神经功能缺损也逐渐加重，显示神经缺陷与脑梗死体积的扩大相一致。Li等［25］最近的研究结果得出了类似的结论，脑缺血发生后神经损伤评分和脑梗死体积均急剧增加。另外，在此阶段，半暗区中LC3 和C-caspase-3 的表达水平逐渐增加，并且在12 h达到最大。如上所述，同样得到自噬和凋亡相关蛋白Beclin-1、Bcl-2 和Bax 的数据支持［26］。因此，可以通过调节自噬和凋亡的活化程度、抑制梗死体积的扩张和促进急性期的细胞存活来提供神经保护功能。之后，亚急性期脑梗死体积从12 h 逐渐增大至28 d，同时，神经感觉和运动功能缺陷也显著增加。然而，半暗区的自噬和凋亡在这个阶段显示出不同的变化：LC3 的表达水平在12 h 后持续下降并在2 d 降至非常低的水平，C-caspase-3 的表达水平也降低，但是降低相对自噬较轻并仍然维持在高水平，表明自噬表达的下降可能是导致神经功能缺陷增加的主要原因。这一结果实际上与以前的研究不一致［27］，其显示自噬抑制在脑缺血中具有神经保护作用。分析不难发现，不同的动物模型、干预措施以及时点可能会导致相反的结果。惊讶的是，脑I/R 损伤2 d 后LC3 表达水平突然改善，自噬明显增加。相反，C-caspase-3 表达水平持续快速下降至28 d。这些结果提示2～28 d 亚急性期可能出现细胞凋亡向自噬的转换，这种转换在脑I/R 病理生理过程中发挥重要功能。因此，对于自噬和凋亡在大鼠脑缺血中的研究应该结合不同时期的特征时点进行综合有效的分析救治，不论在时间上还是不同细胞分子信号机制的联系上。

有研究指出，自噬和凋亡的激活机制不仅发生在神经元中［28］，而且在神经胶质细胞中［29］，甚至二者发生在同一个细胞中［30］。Xu 等［31］通过免疫荧光检测脑I/R 后6 h 星形胶质细胞的自噬显著增加，但在缺血后12～24 h 其表现出凋亡和坏死形态特征。因此，我们预测在本研究中2 d后从细胞凋亡到自噬的转变主要发生在神经元而不是星形胶质细胞中，并且大多研究结果也指示自噬多发生在神经元中［32］。此外，在脑I/R 后4 d 梗死体积已达最大值，但LC3 和C-caspase-3 的表达仍可持续检测，表明梗死体积不能完全代表坏死［33］，因为TTC 染色标记的是组织中线粒体的活性，在半暗区中反而自噬和凋亡对细胞的存活有较大影响［34］。

综上所述，本研究表明脑缺血半暗区的自噬和凋亡在脑I/R 后表现出不同的时间变化，可以将急性期（6 和12 h）及亚急性期（2、7 和28 d）作为脑I/R 大鼠模型中自噬与凋亡研究的特征时点。本实验为研究者进一步的机制研究提供了较为可靠的时点选择。重要的是，我们发现在大鼠脑缺血亚急性期可能存在从细胞凋亡到自噬的转换，半暗区的细胞凋亡水平显著降低，但自噬仍维持在高水平，二者存在一定的相互作用，因此我们推测减弱过度自噬可能是此阶段脑卒中治疗的优先任务。