耿 婷 南 琼

结直肠癌是全球性的健康问题，约占世界年度诊断所有癌症和癌症相关死亡人数的10%[1]。研究显示，预计在2030年全球结直肠癌新发病例将超过220万例，将有近110 万结直肠癌患者死亡[2]。我国结直肠癌的发生率和病死率也居高不下，严重影响人民的健康和生活质量。除非可以早期诊断并进行手术干预，否则结直肠癌预后很差。但结直肠癌发展过程缓慢，许多患者直到转移后才会出现下消化道出血或腹痛等症状，而且在有症状的患者中，约有60%～70%确诊病例是在疾病的晚期被发现的[3]。失去手术治疗机会的患者只能选择药物治疗，标准化疗方案主要包括氟尿嘧啶类药物，联合奥沙利铂或伊立替康。针对血管内皮生长因子(VEGF)和内皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体也被批准用于治疗晚期转移性结直肠癌。目前抗EGFR单克隆抗体治疗已经成为结直肠癌标准治疗的一部分。

越来越多的研究表明，KRAS突变的结直肠癌患者对抗EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗会产生耐药，在治疗过程中KRAS的后续突变也会使患者对其反应性下降，影响治疗效果。因此对计划使用西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者进行KRAS基因突变检测十分有必要[4]。虽然许多研究都表明KRAS基因突变的结直肠癌患者对抗EGFR单克隆抗体的治疗耐药且强调了使用前检测并剔除这类患者的必要性，但是目前对于该人群的治疗尚无较好的方法，开发新的治疗方法对降低结直肠癌病死率有重大意义。本文主要综述了miR-7-5p、Raf-1在疾病中的研究进展及两者在结直肠癌发生、发展、治疗中的作用，为进一步研究两者在治疗包括KRAS突变患者在内的结直肠癌患者中的潜在作用提供依据。

一、miR-7-5p研究进展

microRNAs(miRNAs)是一类全长约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，其通过与靶mRNA的3′非编码区(3′untranslated region，3′UTR)中特定位点结合负向调节基因表达，参与各类病理生理过程[5]。越来越多的研究证实，正常组织与肿瘤组织中miRNAs的表达存在显著差异，miRNAs在肿瘤的发生、发展中起着重要的调控作用。microRNA-7-5p(miR-7-5p)作为miRNAs中的一员，在许多疾病中均存在差异表达，例如在黑色素瘤、膀胱癌等疾病中作为肿瘤抑制基因，表达下调，而在小肠神经内分泌肿瘤表达上调[6～8]。

Giles等[6]研究发现，与原发性黑色素瘤细胞比较，转移性黑色素瘤细胞中miR-7-5p表达量降低，在体外增强miR-7-5p的表达可显著降低肿瘤细胞的存活率、集落形成和诱导细胞周期阻滞。此外，异位表达miR-7-5p可减少黑色素瘤细胞在体外的迁移和侵袭，减少体内转移。他们证明了miR-7-5p是一种有效的黑色素瘤生长和转移抑制剂，且部分是通过失活RELA/NF-κB信号来实现，miR-7-5p替代疗法可能在黑色素瘤的治疗中发挥重要作用。Dong等[9]研究发现，miR-7-5p在结直肠癌患者组织和HCT116、SW480、SW620细胞系中均表达下调，低表达的miR-7-5p与结直肠癌临床分期晚、组织学分化差、预后不良均有关系，miR-7-5p的低表达能够预测结直肠癌患者较差的5年总生存率。他们还通过体外实验研究表明，miR-7-5p过表达可抑制结直肠癌细胞增殖和迁移。

此外，结直肠癌中的癌基因KLF4(krüppel-like factor 4)也被证实是miR-7-5p的直接靶点。KLF4的过表达可挽救miR-7-5p对大肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用。这些实验结果均提示了miR-7-5p是治疗人结直肠癌的潜在分子靶点。另一个研究通过在人结直肠癌细胞系SW480中过表达miR-7-5p后，发现其可抑制结直肠癌细胞增殖和迁移，而且敲除lncRNA ZFAS1减弱其对miR-7-5p的海绵作用可以抑制肿瘤的生长、迁移和侵袭，并诱导结直肠癌细胞凋亡，miR-7-5p抑制剂会增强SW480细胞的侵袭和迁移能力，降低结直肠癌细胞凋亡率[10]。类似的，另外一个研究也表明抑制miR-7-5p表达会促进结直肠癌的发展[11]。以上研究均提示了miR-7-5p在结直肠癌发展过程中发挥着重要的抑制作用，是十分有价值的治疗靶点。

笔者课题组在前期研究中也利用Miseq高通量测序分析发现与癌旁正常组织比较，结直肠癌组织中miR-7-5p低表达，并且通过qRT-PCR实验也证实了其下调趋势，细胞实验还表明上调miR-7-5p可抑制结肠癌细胞CaCo-2的增殖，并促进其凋亡[12]。因此深入研究miR-7-5p抑制结直肠癌发展的作用机制可为治疗结直肠癌提供新的治疗靶点和研究方向。

二、Raf-1研究进展

Raf-1是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导途径中的重要成员，在细胞增殖、分化及凋亡中起着重要作用。Raf-1位于Ras下游，由生长因子激活特异的受体酪氨酸激酶而激活，激活的Raf-1可以磷酸化活化的蛋白激酶MEK1和MEK2，从而磷酸化激活丝氨酸/苏氨酸特异的蛋白激酶ERK1和ERK2，这些蛋白激酶在调控细胞分裂、凋亡、分化和迁移相关基因的表达中发挥重要作用[13]。Raf-1已经被报道在多种人类癌症中具有致癌作用，在包括前列腺癌、肺癌、甲状腺癌、结直肠癌等多种疾病中被发现与肿瘤细胞的侵袭、迁移能力相关[14～17]。

研究证实，FBXL19-AS1沉默可通过靶向miR-431-5p/Raf-1来抑制肺癌的进展和血管生成，提示FBXL19-AS1/miR-431-5p/Raf-1轴有可能成为抑制肺癌血管生成、改善预后的新的生物学诊断/治疗靶点[15]。有研究者发现与对照组中未敲除Raf-1的结直肠癌细胞比较，大多数包括KRAS突变在内的敲除Raf-1的癌细胞具有大空泡和杯状等形态，这表明敲除Raf-1的一组肿瘤细胞有更明显的分化。MUC2和PAS染色也证实Raf-1敲除的癌细胞呈现出杯状表型。在其余实验中还观察到的Raf-1敲除的细胞有更高程度的聚集和附着，且极性恢复。微阵列数据也进一步支持Raf-1敲除使肿瘤组织正常化。引人注目的是，Raf-1敲除后改变的基因还可以完全将健康的结肠组织与肿瘤组织区分开来。这些数据均证实Raf-1的敲除可以恢复结直肠癌细胞的极性并使组织结构正常化。抑制Raf-1激酶活性可抑制肿瘤生长，恢复结直肠癌细胞的极性。这些结果都表明在结直肠癌细胞中敲除或抑制Raf-1可抑制癌细胞的增殖并使癌细胞正常化。这为治疗包括KRAS突变患者在内的结直肠癌提供了一条新的思路[17]。

早期研究表明，Raf-1在结直肠癌组织中高表达，并且结直肠管状腺瘤癌变过程中的Raf-1阳性表达率呈逐渐升高趋势，提示Raf-1在腺瘤发生及癌变过程中发挥着一定作用[18]。而后越来越多的证据表明，Raf-1/MEK/ERK信号通路的激活可通过调节细胞周期，影响细胞增殖；促进血管内皮生长因子的表达进而促进血管生成；诱导基质金属蛋白酶等蛋白水解酶促进细胞的迁移和侵袭等多种方式参与结直肠癌的发生、发展。Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)是一种内源性Raf-1抑制剂，可抑制肿瘤细胞的转移扩散，在许多人类恶性肿瘤中均能观察到RKIP表达降低。在结直肠癌患者中，胞质RKIP的丢失与肿瘤进展、远处转移和低生存率有关[19]。

除此之外，还有研究指出Raf-1在促进细胞增殖、侵袭，抑制细胞凋亡等过程中发挥重要作用可通过多条途径，并不仅仅依赖于MEK-ERK途径。凋亡信号调节激酶1(ASK1)是一种应激诱导的促凋亡蛋白，其过表达可通过线粒体依赖的caspase激活途径引起许多细胞系的凋亡。研究发现ASK1可被未激活的Raf-1抑制。即Raf-1阻断ASK1的功能不需要通过MEK-ERK通路[20]。有趣的是，研究还表明在结直肠癌中Raf-1是维持人结直肠癌细胞克隆形成和致瘤能力所必需的，包括KRAS突变的结直肠癌细胞。抑制Raf-1能显著提高MEK抑制剂在KRAS突变肿瘤中的效率，导致永久性的MEK-ERK抑制和凋亡。Raf-1抑制还能以不依赖MEK-ERK的方式恢复肿瘤细胞顶面-底侧极性和紧密连接，抑制肿瘤生长[17]。另一研究结果也显示当沉默Raf-1时，具有KRAS突变(G13D)的HCT116细胞表现出更明显的凋亡[21]。以上研究均提示，在寻求新的结直肠癌(尤其是KRAS突变患者)治疗方法时，抑制Raf-1似乎是一个不错的选择。

三、miR-7-5p与Raf-1及结直肠癌

靶基因预测网站(http:∥www.targetscan.org; http:∥mirdb.org)显示Raf-1是miR-7-5p的靶基因之一。且有研究发现与正常脑毛细血管比较，胶质母细胞瘤微血管中miR-7-5p明显下调，且与Raf-1蛋白水平呈显著负相关。该团队利用人脐静脉内皮细胞行双荧光素酶报告基因实验验证了两者的靶向关系。miR-7-5p作为肿瘤抑制基因可能通过靶向Raf-1癌基因抑制胶质母细胞瘤微血管内皮细胞增殖，在胶质母细胞瘤的发病机制中起重要作用。这对抗肿瘤血管生成药物的开发具有一定的指导意义[22]。

另一项研究也证实了Raf-1是miR-7-5p的靶点，并确定CIRC_0006528可海绵化miR-7-5p促进Raf-1的表达并激活MAPK/ERK通路来促进乳腺癌细胞的生长、侵袭和迁移。该研究首次提供了CIRC_0006528/miR-7-5p/Raf-1/MEK/ERK调控网络参与乳腺癌发生、发展的证据，提示CIRC_0006528是乳腺癌潜在的治疗靶点和预后预测指标[23]。

在H295R异种移植实验中，通过纳米粒将miR-7-5p和miR-NC通过静脉给药发现其可抑制细胞系和患者来源的异种移植瘤中人肾上腺皮质腺癌细胞的生长，这说明抑制miR-7-5p实现疾病治疗是可以实现的。同时在H295R细胞中过表达miR-7-5p可降低细胞中Raf-1的表达水平，且在该细胞系内使用双荧光素酶报告基因实验也证实了两者的靶向关系[24]。然而miR-7-5p与Raf-1在结直肠发生、发展中的关系及机制尚未有相关报道。

四、展 望

近年来多项研究已经表明，miR-7-5p及Raf-1各自在结直肠癌研究中发挥的重要性，而结直肠癌发生率、病死率依然居高不下，且西妥昔单抗等抗EGFR单克隆抗体临床使用后的耐药性缺陷也逐渐显露出来，大量临床试验表明患者的耐药性与KRAS突变有关。而Raf-1是RAS的下游因子，通过抑制Raf-1进行结直肠癌的临床治疗可避开KRAS突变引起的耐药性，同时miR-7-5p也是结直肠癌潜在诊断标志物和治疗靶点。目前已有研究在其他疾病中证明了miR-7-5p与Raf-1存在靶向关系。因此在未来研究中，阐明两者在结直肠癌中的作用机制，确定结直肠癌细胞中miR-7-5p是否可以靶向抑制Raf-1表达从而影响疾病进展，进一步探索两者对于结直肠癌的治疗作用对提高包括KRAS突变在内的结直肠癌患者5年生存率、降低病死率具有重要意义。