杨佳雯 谢双双 叶乐驰

转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的治疗是临床工作中的重点和难点之一[1]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是上皮生长因子细胞增殖和信号转导的受体，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。目前，靶向EGFR的单克隆抗体是治疗mCRC的一个突破[2]。其代表药物西妥昔单抗，通过竞争性阻断EGFR与其配体EGF等的结合,阻断EGFR下游的信号转导途径,进而抑制肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭和转移。经过一系列临床试验验证，西妥昔单抗治疗可以增加晚期患者的手术机会，提高mCRC患者的总生存率，已经被成功应用于mCRC的治疗[3]。

2008年后一系列临床研究进一步发现，RAS基因野生型患者从西妥昔单抗治疗中获益更大，这对传统治疗模式的选择产生了重要影响，使精准化个体治疗从愿望走向了现实[4，5]。然而，临床上仍有部分RAS野生型CRC患者在接受西妥昔单抗治疗时出现无效或耐药[6]。可见深入研究西妥昔单抗耐药的机制，并进一步寻找潜在的能有效预测靶向治疗效果的生物学标志物是十分迫切且有必要的。近年来研究表明，非编码RNA通过多种机制影响CRC的发生、发展，这也有利于找到更多的生物学标志物，为解决西妥昔单抗耐药提供很好的思路。

一、非编码RNA的概述

非编码RNA是指能从基因组上转录但不能翻译成蛋白质的RNA。根据长度，非编码RNA可分为长链非编码RNA(>200nt)、微小非编码RNA(≤200nt)和环状RNA。非编码RNA在转录、RNA加工和翻译水平上调节基因表达，且每个非编码RNA都具有不同的功能，仅在人类基因组中就可能有10000个长链非编码RNA有待研究，因此可以预测，非编码RNA的数千种新功能有待被发现[7]。过去20年的研究揭示了新类别的非编码RNA，包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)等，所有这些非编码RNA都具有不同的调节功能，有效地反馈到更大的RNA通信网络中，最终调节细胞功能的基本蛋白效应器[8]。

二、与西妥昔单抗耐药相关的miRNA

miRNA是短的、非编码的核苷酸序列，其通过与靶mRNA的3′非编码区(3-UTR)中的互补位点结合来调节基因表达[9]。研究证实，miRNA可通过APC丢失、PTEN/PI3K途径失调和SRC过表达触发、促进肿瘤转化和进展[10]。

1.let-7:let-7家族是人类恶性肿瘤中研究最多的miRNA之一。通常通过下调参与控制细胞周期或细胞内信号级联的癌基因来充当肿瘤抑制因子[11]。KRAS是let-7的既定靶标，let-7互补位点6(LCS-6)的单核苷酸多态性(SPF)，破坏了let-7结合并上调了KRAS的表达[12]。Zhang等[13]对130例入选西妥昔单抗单药治疗Ⅱ期研究(IMCL-0144)的mCRC患者评估了KRAS、let-7、LCS-6多态性的存在，结果表明KRAS的3′UTR多态性可以预测KRAS野生型mCRC患者西妥昔单抗的反应性。Ruzzo等[14]研究分析了let-7a在用西妥昔单抗治疗的具有KRAS突变的mCRC患者中的表达水平，其研究显示，let-7a的上调可使具有KRAS突变的患者从抗EGFR治疗中获得生存益处，可能潜在地用于改善西妥昔单抗的耐药。

2.miRNA-181a: miRNA-181a在CRC中可改变Wnt/β-连环蛋白信号转导。然而，miRNA-181a在CRC中的作用及其预测存活和对靶向EGFR药物的反应能力尚未被探索。Pichler等[15]对80例接受西妥昔单抗和帕尼单抗治疗的KRAS野生型mCRC患者进行了分析。研究表明，miRNA-181a在肿瘤组织中的低表达与KRAS野生mCRC患者中较差的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)相关。Kaplan-Meier曲线显示出miRNA-181a低表达患者的OS缩短(P=0.019),miRNA-181a低表达还与不良PFS相关(P=0.015)。

3.miRNA-345：miRNA-345是所有患者以及非KRAS突变人群中OS和PFS的单一预后生物学标志物。为研究接受西妥昔单抗和伊立替康治疗的mCRC患者的总生存率，Schou等[16]在138例接受西妥昔单抗和伊立替康三线治疗的mCRC患者中，从全血中分离并分析了738个预处理miRNA，其中KRAS、BRAF和PIK3CA是突变状态。结果发现6种miRNA(miRNA-345、miRNA-143、miRNA-34a、miRNA-628-5p、miRNA-886-3p和miRNA-324-3p)与短OS相关。其中miRNA-345是最强的预后miRNA，在整个队列和非KRAS突变体群体中均具有重要意义。

4.let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b: 为评估西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的两个不同的mCRC患者队列中的miRNA表达，并研究miRNA是否可预测mCRC患者对抗EGFR单克隆抗体的敏感度，Cappuzzo等[17]通过纳入来自2个独立队列(队列1∶74例，验证队列：109例)的西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的183例mCRC患者，并用分析miRNA序列的方法鉴定了let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b是与抗EGFR治疗结果不同的标志。在队列1中，具有高let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b表达的患者的PFS和OS明显更长。在验证队列中，具有高表达患者也具有更长的PFS和OS。在KRAS野生型人群(120例)中，高表达患者的PFS和OS也明显更长。但在KRAS突变患者中比较差异无统计学意义。由此，他们得到let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可改善KRAS野生型mCRC患者的选择，作为抗EGFR治疗的良好候选者的结论。因此let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b可能在mCRC西妥昔单抗耐药中发挥作用，并影响了西妥昔单抗或帕尼妥单抗治疗的mCRC患者的PFS和OS。

5.miRNA-31-5p/3p:可能参与调节BRAF的活化并在CRC的EGFR下游的信号通路中发挥作用。Igarashi等[18]研究分析了102例接受抗EGFR治疗的CRC患者在EGFR下游途径中的miRNA-31-5p表达情况。实验表明，在携带所有野生型基因的CRC中，高miRNA-31-5p与较短的PFS相关，表明它可能是抗EGFR治疗预后的生物学标志物。Mlcochova等[19]在28例为西妥昔单抗治疗的RAS野生型mCRC患者和24例为帕尼单抗治疗的RAS野生型mCRC患者中鉴定出9种对西妥昔单抗治疗的应答者和无应答者之间表达显著不同的miRNA。进一步评估成功证实，在用西妥昔单抗治疗的患者中高miRNA-31-3p和miRNA-31-5p与低进展时间(TTP)强相关。他们猜测miRNA-31-5p/3p可能是RAS野生型mCRC患者西妥昔单抗应答的预测生物学标志物。Manceau等[20]则研究认为miRNA-31-3p可能是一种新的mCRC生物学标志物，其表达水平可用于识别对抗EGFR治疗产生反应的KRAS野生型mCRC患者。综上所述，miRNA-31-5p/3p有希望成为KRAS野生型mCRC患者抗西妥昔单抗应答的预测性生物学标志物，需要进一步研究。

6.miRNA-133b: miRNA-133b可直接靶向EGFR并抑制其在CRC细胞中的表达水平来抑制CRC细胞的生长和侵袭。Zhou等[21]研究表明，在人CRC组织和细胞系中miRNA-133b表达水平下调。与单独治疗比较，miRNA-133b模拟物和西妥昔单抗的联合治疗显示出更好的抑制大肠癌细胞生长和侵袭的效果。他们的研究明确了miRNA-133b/EGFR相互作用在大肠癌细胞中的作用，提示西妥昔单抗与miRNA-133b联合治疗大肠癌是积极的，可能是未来治疗大肠癌的一种潜在新疗法。

7.miRNA-7: miRNA-7是包括CRC在内的所有恶性肿瘤中的肿瘤抑制因子，能有效抑制CRC细胞的增殖。Suto等[22]研究表明miRNA-7可通过抑制EGFR信号转导改变西妥昔单抗耐药的HCT116和SW480细胞(含有KRAS突变)和HT29细胞(含有BRAF突变)中的西妥昔单抗敏感度。西妥昔单抗治疗不会降低HCT116和SW480细胞的增殖，但在miRNA-7前体处理的HCT116和SW480细胞中，西妥昔单抗的敏感度增加。该研究即使存在KRAS突变，miRNA-7高表达的原发性CRC中的西妥昔单抗敏感度也高于miRNA-7低表达的CRC。因此，miRNA-7可能是CRC中西妥昔单抗耐药标志物。

8. miRNA-375: 结缔组织生长因子(CTGF)是EGFR的配体，且CTGF在大肠癌组织中的表达明显高于相应的正常结肠组织。Alam等[23]研究证明，miRNA-375的过表达通过降低CTGF表达调节人CRC细胞和组织中的EGFR信号通路，来抑制细胞存活、增殖、迁移和血管生成。此外miRNA-375过表达和西妥昔单抗共同治疗的结果显示它们协同增强了CRC细胞的凋亡和坏死。因此，miRNA-375具有与西妥昔单抗耐药相关的治疗价值。

9. MIR100HG衍生的miRNA-100和miRNA-125b: 原发性耐药和获得性耐药主要是遗传改变所导致的，而耐药则是抗EGFR治疗的障碍。Lu等[24]在西妥昔单抗耐药的细胞中发现MIR100HG和两个衍生的miRNAs(miRNA-100，miRNA-125b)过表达。此外，在西妥昔单抗耐药的CRC以及在西妥昔单抗治疗进展中的CRC患者的肿瘤中也观察到MIR100HG、miRNA-100和miRNA-125b的过表达。研究人员发现，miRNA-100和miRNA-125b协调抑制着5个Wnt/β-连环通路通路的负调节因子(DKK1、DKK3、ZnFR3、RNF43和APC2)，导致Wnt信号转导增加，在西妥昔单抗耐药细胞中通过抑制Wnt可恢复西妥昔单抗的反应性。同时，研究表明MIR100HG和转录因子GATA6之间存在双负反馈回路，转录因子GATA6对MIR100HG具有抑制作用，但是这种抑制被以GATA6为靶点的miRNA-125b所解除。这些发现确定了西妥昔单抗临床可行的表观遗传因素。

三、与西妥昔单抗耐药相关的lncRNA

lncRNA通过干扰miRNA的活性，直接与蛋白质结合来调节它们的活性或改变它们的定位。通过抑制RNA聚合酶影响下游基因表达，以及作为竞争性内源RNA调节基因表达在生物过程中起重要作用[8]。随着CRC新型分子和表观遗传机制的发现，lncRNA已成为诊断、预后和治疗中应用价值不断上升的生物学靶标。近年来也有研究发现，lncRNA在CRC等肿瘤细胞的耐药中发挥关键作用。

1.LINC00973: Jing等[25]建立了西妥昔单抗耐药细胞系(H508/CR)，并进行了RNA测序，验证lncRNA的表达水平后，对表达水平上调最显著的lncRNA分子LINC00973进行RNA-FISH检测。结果证实，H508/CR细胞中LINC00973表达水平升高。此外，LINC00973抑制作用使葡萄糖消耗和乳酸分泌分别降低。敲低该lncRNA后，细胞活力降低，细胞凋亡增加，葡萄糖消耗和乳酸分泌减少，并可以改善H508细胞对西妥昔单抗的耐药性。因此，LINC00973表达水平可用于预测西妥昔单抗耐药性的预后。

2.POU5F1P4: Peng等[26]在西妥昔单抗治疗的mCRC队列中进行了lncRNA表达谱分析。研究发现9种lncRNA差异表达，其中有5种与患者的PFS显著相关。在这5个lncRNA中，POU5F1P4在获得性西妥昔单抗耐药细胞以及西妥昔单抗耐药患者中均下调。他们对POU5F1P4共表达的蛋白编码基因进行了研究。9个POU5F1P4共表达基因(AREG、CKB、ERG、MYC、NOX1、SLC39A2、ANO1、CYP3A5和NT5E)在疾病对照组和无应答组之间比较，差异有统计学意义，并发现共表达的基因在EGFR结合上显著富集。证明POU5F1P4的下调降低了CRC细胞对西妥昔单抗的敏感度。实验表明了lncRNA在西妥昔单抗耐药中的潜在作用，并可能为发现新的生物学标志物和治疗靶标提供有用的信息。

3.UCA1: 尿路上皮癌相关1(UCA1)是一种具有3个外显子的lncRNA。Yang等[27]研究发现西妥昔单抗耐药细胞及其外显体中UCA1水平的上调。他们从西妥昔单抗敏感的Caco-2细胞中培养出西妥昔单抗耐药细胞株Caco2-CR，并用检测UCA1的表达水平。结果显示Caco2-CR细胞中UCA1的表达明显高于Caco-2细胞。此外，他们检测了Caco2-CR细胞(CR-exo)和Caco2-CS细胞(CS-exo)来源的外显体中UCA1的水平，发现CR-exo中的UCA1水平明显高于CS-exo，表明UCA1主要集中在Caco 2-CR细胞来源的外显体中，而且UCA1的表达可能与西妥昔单抗耐药有关。

四、环状RNA

环状RNA(circRNA)是一类非编码RNA，数以千计的内源性circRNA存在于哺乳动物细胞中，它们通过与miRNA或其他分子结合，然后抑制其功能，在转录或转录后的水平上调节基因表达，从而影响肿瘤发生和癌症通路的调节。基于circRNA在癌症中的功能，Qu等[28]和Zhang等[29]研究认为circRNA有希望作为诊断肿瘤的生物学标志物。Hansen等[30]在人和小鼠脑中发现了高表达的circRNA,证明了circRNA可充当miRNA-7海绵，称此为miRNA-7的环状RNA海绵(ciRS-7)。CiRS-7含有70多个选择性保守的miRNA靶位点，并且以miRNA-7依赖性方式与Argonaute(AGO)蛋白高度相关。尽管circRNA对miRNA介导的靶向去稳定化具有完全抗性，但它强烈抑制miRNA-7活性，导致miRNA-7靶标水平增加。而miRNA-7是包括CRC在内的所有恶性肿瘤中的肿瘤抑制因子，能有效抑制CRC细胞的增殖，且miRNA-7在CRC中可能存在西妥昔单抗耐药标志物，所以ciRS-7可能会成为CRC中有效的西妥昔单抗耐药标志物。

五、展 望

综上所述，非编码RNA特别是lncRNA、miRNA及circRNA在西妥昔单抗的耐药机制中起着至关重要的作用，对包括结直肠癌在内的恶性肿瘤的治疗具有深远意义。lncRNA、miRNA及circRNA均可通过介导EGFR信号通路调节西妥昔单抗的敏感度，此外，lncRNA还可通过调节糖代谢及Wnt信号通路导致西妥昔单抗耐药。随着生物信息学技术的发展，会有越来越多的与结直肠癌中西妥昔单抗耐药相关的新非编码RNA被发现。目前对非编码RNA的研究也正处于初步阶段，其具体调控的机制，需要进一步探索。